苏云金杆菌营养期杀虫蛋白Vip3Aa与其受体Sf-SR-C的结构及分子作用机制研究

Bacillus thuringiensis (Bt) is the most extensively used biopesticide worldwide. The vegetative insecticidal proteins (Vip), secreted by many Bt strains during their vegetative growth stage, are regarded as a new generation of insecticidal toxins. However, the insecticidal mechanisms of Vips have been little studied. In particular, there has been no report on the crystal structure of Vip3A to date, which seriously restricts the study of its insecticidal mechanism and application. This project aims to solve the crystal structures of the protoxin and activated toxin of Vip3Aa, which will reveal the structural composition of Vip3Aa and the influence of protease “activation” on its structural changes and functions. In addition, we will solve the crystal structure of Vip3Aa in complex with its receptor Sf-SR-C. These structures will reveal the detailed mechanisms how Vip3Aa interact with Sf-SR-C, showing their binding specificity. On the basis of structure, we will analyze and validate the functions of Vip3Aa's important domains and the key sites of protein-protein interactions, which will provide useful information for the directional evolution of Vip3Aa in improving its insecticidal activity and insecticidal range. Study on the structure and function of the protoxin, activated toxin and receptor binding state of Vip3Aa will significantly facilitate the study of its insecticidal mechanism and application.

苏云金芽胞杆菌（Bt）是目前世界范围内生物农药中应用最成功的一种杀虫微生物。Bt营养期杀虫蛋白（Vip）被认为是新一代的杀虫蛋白，但是关于其杀虫机制的研究还处于初级阶段，尤其是没有Vip3A类蛋白（近101种）三维结构的报道，极大地限制了其杀虫分子机制和实际应用的研究。在我们前期对其功能研究的基础上，本项目将首先解析Vip3Aa原毒素和激活毒素的结构，揭示Vip3Aa的结构组成及“激活”过程对其结构和功能的影响。然后，解析Vip3Aa与其受体Sf-SR-C复合物的结构，阐明Vip3Aa与Sf-SR-C相互作用的分子机制，揭示其结合特异性。我们将在结构的基础上分析和验证Vip3Aa重要结构域的功能和蛋白间相互作用的关键性位点，为提高Vip3Aa蛋白杀虫活性和杀虫范围等方面的定向改造和研究提供理论支持。以上研究将会显著促进Vip3Aa杀虫分子机制的阐明，为其研发应用打下坚实的理论基础。

Bt所产生的营养期杀虫蛋白Vip3被认为是继Cry蛋白之后第二类具有实际应用前景的微生物杀虫蛋白，并已在转基因作物中得到了初步的应用。但是Vip3类蛋白杀虫机制的研究还处于初级阶段，尤其是关于其具体的结构与功能的研究的缺失，极大地限制了对其杀虫分子机制和实际应用的研究。我们针对Vip3A蛋白的结构和功能展开了深入的研究。.1）首先，我们解析了Vip3A蛋白C末端（Vip3A200-789）的高分辨率的晶体结构。首次揭示了Vip3A蛋白C末端的具体结构架构。Vip3A200-789由四个结构域组成，通过荧光结合实验，我们发现结构域 II-III参与了Vip3A和Sf9细胞的结合。通过结构的比对和预测，我们发现结构域 IV和结构域 V是潜在的糖结合结构域。另外，通过细胞毒性检测和害虫生测结果显示Vip3A200-789没有杀虫毒性，说明结构域 I（Vip3A1-199）在Vip3A的正确组装和致毒过程中发挥重要作用。.2）我们进一步研究了Vip3A的多个结构域在其对草地贪夜蛾幼虫发挥毒性过程中的具体功能。我们证明（1）结构域II-III主要负责Vip3A与草地贪夜蛾中肠组织细胞的结合.（2）结构域I-III是Vip3A发挥细胞毒性的核心结构域。（3）结构域I对维持Vip3A原毒素的四聚化是必须的，并且稳定的四聚化对Vip3A在蛋白酶环境下保持稳定性是必须的。（4）结构域V通过其糖结合能力可与中肠内的围食膜结合，该结合对Vip3A的杀虫活性是至关重要的。.3）在对Vip3A结构与功能研究的基础上，我们进一步探索了提高其杀虫活性的方法。我们发现在Vip3A结构域I和结构域II之间的连接区域存在多个酶切激活位点，并且Vip3A的杀虫活性与其酶切效率相关。我们进一步证明在结构域I和结构域II之间增加高效的酶切位点可以显著地增加其被幼虫中肠蛋白酶切割的效率，相应的可以进一步增加其杀虫活性。.总之，我们解析了Vip3A200-789的高分辨率的晶体结构，并进一步深入研究了Vip3A的多个结构域在对草地贪夜蛾幼虫发挥毒性过程中的功能，同时我们提出了一个可能行的增加Vip3A杀虫活性的策略。以上研究结果将会显著地促进Vip3A杀虫机制的阐明，为其科学合理的应用打下坚实的理论基础。

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