CCoAOMT和COMT在柳枝稷木质素合成中的功能及其所介导的3位氧甲基化途径间的协同作用

A particular challenge to the progress of feasibly producing next generation biofuels is that the presence of lignin in cell walls negatively impacts the bioconversion of lignocellulosic biomass. Genetic manipulation of lignins a valuable strategy to increase saccharification efficiency of cell wall polysaccharides and therefore accelerate biofuel production. Two distinct O-methyltransferases, COMT (caffeic acid 3-Omethyltransferase) and CCoAOMT( caffeoyl coenzyme A 3-Omethyltransferase) , are in charge of methylation of benzene during lignin biosynthesis. The cooperation mechanisms between CCoAOMT and COMT are different among various plant, which is also unclear in the important lignocellulosic energy plant- switchgrass. This project plan to reduce the enzyme activities of CCoAOMT and COMT respectively by produce CCoAOMT-RNAi，COMT-RNAi and CCoAOMT, CCoAOMT-COMT-RNAi transgenic switchgrass plants. Functions of CCoAOMT and COMT in methylation of 3’- hydroxy of lignin intermediate would be studied by comparing the S/G ratio of lignin, type and content of lignin intermediate of the three transgenic plants, and the kinetic properties of recombinant switchgrass COMT and CCoAOMT in vitro. This work would be helpful to identify potential targets for either modification or degradation of lignin. Transgenic plant with high biomass and saccharification efficiency obtained in this work would be ideal candidate for bioethanol production.

维管植物中木质素单体的3位和5位酚羟基的甲基化主要由咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（CCoAOMT）和咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）分别负责。虽然体外酶活性分析显示COMT能有效催化木质素中间体的3位氧甲基化反应，但大多数植物中干扰COMT的正常功能并不能引起相应的G型木质素单体改变。我们先前研究表明，在能源植物柳枝稷中抑制COMT的基因表达，可显著降低G型和S型木质素单体的积累，暗示柳枝稷COMT在木质素3位氧甲基化途径中有独特功能。因此本项目在此基础上通过系统分析COMT-RNAi和CCoAOMT-RNAi转基因柳枝稷植株木质素成分和中间体代谢谱，揭示二者在柳枝稷中G木质素单体合成中的具体作用模式。另外，通过同时抑制COMT和CCoAOMT基因家族的表达水平，进一步解析两者所负责的3位氧甲基化途径间的相互协调作用，可以为能源植物和其他重要的农业经济作物的细胞壁工程提供更多更新的靶标。

木质素是一类存在于维管植物次生细胞壁，其与纤维素和半纤维素形成复合体，阻碍细胞壁糖化过程中纤维素酶与纤维素接触，影响细胞壁纤维素的酶解效率，制约木质纤维素类生物质的转化和利用。组成木质素的氧代苯丙醇结构根据甲基化程度的不同分为H、G和S型三种。以前的研究表明，植物细胞壁中木质素的总量、单体的组成均会改变细胞壁的糖酵解效率。本研究以柳枝稷为研究对象，通过单独或组合调控其木质素单体合成途径中氧甲基转移酶基因COMT和CCoAOMT，以及F5H基因的表达，解析其在柳枝稷木质素单体合成途径中的作用。结果表明，PvCOMT、PvCCoOMT两种酶基因均参与柳枝稷木质素 3 位氧甲基化途径，两者协同参与木质素合成途径中 3 位氧甲基化作用。F5H和COMT在S型木质素合成过程中存在显著的协同作用。在在COMTRi植株中，调低其上游F5H基因的表达时，可加剧COMT基因被抑制后S型木质素合成的影响；相反，在COMTRi植物中过表达F5H基因，能够部分甚至完全消除下游COMT基因表达抑制对S型木质素积累的影响。.S型木质素下降是COMT基因表达受到抑制的一个显著标志，然而仍然有一些不一致的报道显示，抑制COMT基因表达后，S型木质素的水平并未发生改变，反而G型木质素发生了下降。该研究表明，在柳枝稷中仅抑制COMT基因表达，能够诱导F5H基因的表达，使原本下降的S型木质素恢复，并导致G型木质素下降，这为先前研究中存在的不一致性提供了一种可能的解释。另外，温室中目标性状显著的基因工程植株生长在田间时，往往会出现性状弱化甚至截然相反的结果，影响基因工程植株的应用。该项目进行的木质素合成途径上下游基因协同调控的研究，为基因工程植株在田间生产中发生目标性状弱化或丢失的风险提供了预警，也为如何在生产中持续保持目标性状稳定指出了一个可能的解决方向，最终帮助育种家通过分子设计合理地培育出更多低成本高细胞壁品质的能源与饲料作物新品种。.在本研究过程中，我们发现，糖酵解效率与木质素的总量成反比，与S/G大小、5-OH G没有直接的线性关系。同时本研究也创制出一批糖酵解效率教野生型提高的植株，可用于将来能源植物新品系的开发。

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