菊科植物两个倍半萜合酶催化产物特异性决定位点的鉴定

结题报告
项目介绍
AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    30900111
  • 项目类别：
    青年科学基金项目
  • 资助金额：
    20.0万
  • 负责人：
    李振秋
  • 依托单位：
    河北大学
  • 学科分类：
    C0204.水分和营养物质的运输与代谢
  • 结题年份：
    2012
  • 批准年份：
    2009
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2010-01-01 至2012-12-31

项目摘要

对萜类化合物进行深入研究不仅在理论方面能够使我们更加深入了解生物进化过程中次生代谢物在种群、群落形成过程中的作用，而且在应用方面对开发新的药物具有重要意义。萜类化合物研究中最令人感兴趣的问题是生物是如何产生出数量如此众多的萜类化合物的。萜类环化酶催化机理特别是催化特异性的揭示是解决萜类化合物多样性的首要问题。本项目选择菊科植物中催化产物骨架不同、同源性最高（相似度69%）的青蒿caryophyllene合酶和加拿大一枝黄花germacrene合酶作为研究对象，结合生物信息学和分子生物学研究方法，对这两个酶进行选择性片段替换和定点突变，研究突变后催化特性的改变，以期获得决定这两种酶催化特异性位点信息，为进一步阐明进化关系接近的另四种酶的催化特异性决定位点以及倍半萜合酶功能进化过程中的变化特点打下基础，并为最终实现通过合理设计来改变萜类合酶催化特异性而产生新结构化合物提供新的实验依据。

结项摘要

萜类化合物研究中最令人感兴趣的问题是生物是如何产生出数量如此众多的萜类化合物。萜类环化酶催化机理特别是催化特异性的揭示是解决萜类化合物多样性的首要问题。本项目对菊科植物黄花蒿Amorpha-4,11-diene合酶（ADS） 进行片段替换、删除和定点突变，研究突变后催化特性的改变，最终发现了影响此酶催化特异性的氨基酸位点，并且也明确了活性中心不同位置的氨基酸对酶催化特性的影响，还初步探讨了 C、N两末端的作用。. 对ADS活性中心周围9个氨基酸共18种突变体的功能分析发现，活性中心周围氨基酸的突变对其催化活性和特异性的影响因氨基酸位置不同而有明显差异。其中，（1）位于G1和G2螺旋之间的纽结处的突变（G401A）显著改变了催化产物的比例，显示此处影响酶的催化特异性；（2）位于活性中心区接近底物的的4个芳香族氨基酸W271、Y519、F370、和F514的突变显示， W271和Y519的突变（W271F,Y519L)造成活性完全丧失，而F370、和F514突变（F370L、F514L）后则保持活性，也未引起产物改变。这表明W271和Y519是通过cation-π作用稳定碳正离子中间体的主要氨基酸，F370 和F514所处的位置空腔变大并不影响产物特异性；（3）通过G439的三个突变（G439A、C、V）功能分析发现，G439所处的位置的空腔较小变化（G439A）不影响其活性，但是更大变化则使其活性大大降低（G439C）甚至丧失（G439V）。 另外，通过缺失和点突变初步探讨了黄花蒿ADS C、N两末端的作用。发现：（1）N端对酶的活性的保持具有重要作用，N端缺失20个氨基酸可使酶活性完全丧失，而对N端的两个非常保守的氨基酸R10和W20突变（R10G,W20R）则对活性并无影响，显示N端可能是作为一个整体起作用，单个氨基酸的变化不会影响其活性。（2）C末端的6个氨基酸的缺失对酶活性无影响，而缺失14个氨基酸则使活性完全丧失。. 以上这些发现为进一步阐明进化关系接近的另四种酶的催化特异性决定位点以及倍半萜合酶功能进化中的变化特点打下基础，并为最终实现通过合理设计来改变萜类合酶催化特异性而产生新结构化合物提供新的实验依据。

项目成果

期刊论文数量（2）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
青蒿法呢醇合酶原核表达、纯化与功能鉴定
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    --
  • 期刊：
    中国生物工程杂志
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    李振秋;金亚明;王波;LI Zhen-qiu;JIN Ya-ming;WANG Bo
  • 通讯作者：
    WANG Bo
黄花蒿法呢基焦磷酸合酶、紫穗槐二烯合酶双功能酶基因的构建、原核表达与功能鉴定
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2012
  • 期刊：
    河北农业大学学报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    李振秋;王波;高瑞平;LI Zhen-qiu;WANG Bo;GAO Rui-ping
  • 通讯作者：
    GAO Rui-ping

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  • 通讯作者：
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  • 期刊：
    北京农学院学报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    杨倩;穆星;刘会云;向英;李振秋
  • 通讯作者：
    李振秋

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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