溶杆菌素代谢途径及抑菌分子机理研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
30900929
项目类别：
青年科学基金项目
资助金额：
20.0万
负责人：
罗楚平
依托单位：
江苏省农业科学院
学科分类：
C1401.植物病理学
结题年份：
2012
批准年份：
2009
项目状态：
已结题
起止时间：
2010-01-01 至2012-12-31

项目参与者：
刘永锋；方先文；王晓宇；刘邮洲；聂亚锋；丁芳兵；刘长河；
关键词：
新型抗生素抑菌机理溶杆菌素代谢途径酶蛋白

项目摘要

溶杆菌素是芽孢杆菌分泌的二肽抗生素，具有广谱高效的抑菌活性，在医学上和农业上具有潜在应用价值。虽然溶杆菌素结构早被鉴定，但由于其是通过非核糖体途径合成的次生代谢抗菌物质，其合成代谢途径和关键酶功能至今未清楚阐明。本项目通过转座子诱变技术克隆到生防菌Bs-916产溶杆菌素的功能基因簇，并发现溶杆菌素对水稻纹枯病菌具有高抑制活性。本研究拟采用基因表达技术研究合成溶杆菌素关键酶基因的功能，并利用酶工程技术从头合成溶杆菌素来阐明其合成代谢具体途径。在明确合成溶杆菌素关键酶酶学性质、催化特性基础上，理性组合关键酶和选择底物，创制出结构类似的新型二肽抗生素。本研究还将进一步从水稻纹枯病菌中克隆表达、功能分析溶杆菌素靶标蛋白6-磷酸葡萄糖胺合成酶基因。通过溶杆菌素和创制的新型抗生素对靶标蛋白抑制活性分析、抑制过程分子结构模拟，以及与抑菌活性相互关系来清晰阐明溶杆菌素抑菌机理。

结项摘要

溶杆菌素是枯草芽胞杆菌分泌的二肽抗生素，具有广谱高效的抑菌活性。虽然溶杆菌素结构早被鉴定，但其酶催化合成途径至今未完全阐明。2005年7月德国科学家首次克隆到溶杆菌素的合成基因簇Bac；2009年10月印度科学院对Bac中的BacB进行了研究，鉴定了重组蛋白BacB的三维结构和功能；2010年12月美国哈佛大学尽管利用Bac中部分基因的重组表达产物催化合成了一个全新的化合物，但未达到利用重组酶体外催化合成溶杆菌素的目标。2008年本团队从枯草芽胞杆菌Bs916中克隆到Bac基因簇， 2009年开始采用Bs916中Bac的重组表达产物合成溶杆菌素研究。生物信息学预测Bac编码的BacA属于脱羧酶、BacB属于异构酶、BacC属于NAD依赖的脱氢酶、BacD属于氨基酸连接酶、BacE属于免疫蛋白、YwfG属于转氨酶、YwfH也是一个NAD依赖的脱氢酶。在前期基础上，本团队还推测溶杆菌素的体外酶催化合成可能还需要单加氧酶Ywet及其辅酶FdR和FdX的参与。因此本团队采用大肠杆菌表达体系对上述蛋白的基因进行了重组表达和纯化，然后采用这些重组酶进行了体外催化合成溶杆菌素的研究。研究结果证实了上述酶的催化功能，建立了关键酶BacA + BacB，BacC，ywfG + YwfH产物的检测方法，在添加辅酶FdR、FdX、单加氧酶Ywet和BacD后，质谱检测到了溶杆菌素的合成，并具有拮抗水稻纹枯病菌的生物活性。为进一步明确溶杆菌素拮抗水稻纹枯病菌的机理，本团队从水稻纹枯病菌RH-2中克隆到溶杆菌素的靶标蛋白6-磷酸葡萄糖胺合成酶（Glms）的基因，并对该基因进行了重组表达。重组酶GlmS分子量约为306KDa，是由四个相同大小亚基组成的多聚酶复合体；最适反应温度为37℃，最适pH为6.4，42℃下的半衰期为1 h；催化反应能被溶杆菌素竞争性抑制。为阐明溶杆菌素调控机理，本团队还筛选到一些可能调控溶杆菌素合成途径的一些调控基因。本项研究基本阐明了溶杆菌素的合成代谢途径和抑菌分子机理，但还需要进一步细化；并筛选到一些可能调控溶杆菌素合成的调控基因，为溶杆菌素的开发利用奠定了理论基础。