条件重编程细胞重构人正常宫颈上皮三维模型及其在HSV-2感染性疾病研究中的应用

HSV-2 can establish life-long latent infection and be periodically reactivated. There is no effective vaccine/drug available for HSV-2 infection. Genital epithelium is the primary target for viral infection and replication. The stratified squamous epithelial structure of genital epithelium differs fundamentally from other epithelia. It is of great importance to establish a human cell-based microphysiological system for virus biology research and anti-viral drug discovery. However, the culture of normal epithelial cells in vitro has been a big challenge over decades. The widely used viral or cellular gene-transduced cell lines are not real “normal” cells because of genetic alterations. Most recently, a novel cell technology “Georgetown Method”, also named “conditionally reprogrammed cells (CRC)”, provides a solution. We collaborated with the CRC inventors and have established the first normal CRC cervical epithelial cells originated from Chinese (Han population). We will characterize the normal biological features of this CRC cervical epithelial cell line. And we will reconstitute the polarized and stratified cervical epithelium 3D model using the air-liquid interface approach. More importantly, we will establish and optimize the first human target cells based 3D viral infection model, thereby providing a microphysiological system for studies of HSV-2 (and other sexually transmitted pathogens) infection and anti-viral drugs.

HSV-2感染后病毒终生潜伏、周期性复发，尚无有效的预防或治疗性疫苗和药物。生殖道上皮是HSV-2原发感染靶点和病毒复制位点, 其极化分层结构不同于其它上皮组织 。建立接近人体生理条件的体外病毒感染研究系统对病毒生物学和抗病毒药物研究意义重大。然而正常上皮细胞体外培养这一世界性难题直接影响了上述系统的建立。目前应用的病毒或细胞基因转导的细胞系，并非真正“正常”细胞。最近报道的条件重编程细胞（CRC）技术解决了这一难题。前期我们与该技术的发明人合作，成功建立了第一株中国人的条件重编程正常宫颈上皮细胞并初步鉴定。本申请项目将进一步鉴定该CRC细胞的正常生物学功能，利用CRC细胞重构极化分层的宫颈上皮三维模型。在此基础上，探索建立世界上第一个基于CRC细胞的三维极化上皮病毒感染模型。将为HSV-2（及其它性传播病原体）感染性疾病研究和抗病毒药物筛选提供一个全新的模拟人体的微生理系统。

单纯疱疹病毒II型（HSV-2）感染是最普遍性传播疾病之一，可协同促进HIV传播和卡波氏肉瘤的发生。目前临床上抗病毒治疗并不能彻底清除病毒，现阶段尚无有效的预防性或治疗性疫苗和药物。以往对于HSV-2的研究，大多采用癌细胞系或者永生化细胞系，这些细胞因遗传背景和表型的改变而失去正常细胞生理功能。应用动物模型的研究结果由于种属差异导致很难直接临床应用。HSV-2原发感染部位是生殖道粘膜上皮，继而在骶神经节建立终身性潜伏感染。因此，建立人源正常细胞模型对HSV-2病毒生物学研究和抗病毒新药发现具有重要意义。.本研究通过条件重编程（conditional reprogramming ,CR）技术，未经任何遗传操作分离得到了原代人正常阴道/宫颈上皮细胞（Human normal vaginal epithelial cells ，HNVEC)。该细胞能够在体外快速稳定增殖，76天细胞群体数倍增32代。短串联重复序列STR分析证实是一株全新细胞株。该细胞株具有正常二倍染色体核型，正常DNA损伤应答反应，软琼脂不形成克隆。基质胶三维培养有正常细胞分化能力，特异性表达CK14和p63分子，不表达CK18，证实是一株全新的具有正常生物学特性的人阴道上皮细胞。.通过3D气-液界面（ALI）培养，利用HNVEC重构了极化阴道上皮三维模型，该模型与人阴道上皮组织在形态结构和组织学特性非常类似，都具有基底层、移行层和角化层，特异性表达CK14 、p63、 Laminin、E-Cadherin和Dsg-1上皮标记分子。然后，我们又建立了三维阴道上皮的HSV-2感染模型，能明显观察到从表层角化层到基底层随病毒感染时间延长而渐进发生的组织病变情况以及病毒包膜蛋白的复制。该模型有望克服以往二维培养细胞模型和/或动物模型在HSV-2研究上的局限性，从而对HSV-2感染机制的研究、抗病毒药物研发以及疫苗的研制提供一个更接近于HSV-2自然感染过程全新模型。.最后，我们还初步建立了基于人源正常细胞HNVEC的抗HSV-2的药物筛选模型，初步评价了PAA、TAK-242和ku-55933抗病毒作用效果。结果显示，基于人源正常细胞的抗HSV-2药物筛选模型的结果重复性和一致性明显优于基因永生化细胞系。

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