RGC-32通过G2/M检测点调控肾小管上皮细胞修复的分子机制

The tubular epithial cell repair process has been proved to play a key role in the prognosis of acute kidney injury and chronic kidney diseases. Recent studies have found that G2/M check point is essential in determining the fate of tubular injury: promoting cell cycle from G2 phase into M phase will benefit the restoration of tubular biology and conformation, while the G2/M phase arrest will lead to aggressive remodeling, excessive renal fibrosis and resulted in progression of chronic kidney disease. Our preliminary study has identified that RGC-32(response gene to complement 32) as a molecule regulating G2/M check point, participates in tubular epithial cell repair process. However, the molecular mechanism underlying its regulation of G2/M check point still remains to be elucidated. In this proposal we plan to investigate the role of RGC-32 in tubular epithial cell repair in acute kidney injury animal models. Then we will elucidate the molecular mechanism of G2/M check point regulation of tubular cells in cultured cells and in RGC-32 knockout mice by using molecular biological techniques including molecular cloning, siRNA, immunohistochemnistry and CO-IP. By completing this project, we aim to elucidate the molecular mechanism of tubular injury and repair concerning cell cycle regulation and the role of RGC-32 in the molecular mechanism of tubular epithial cell repair so as to provide candidate therapeutic targets for kidney injury.

肾小管修复过程对各种急慢性肾损伤的临床预后和转归起着关键作用，但有关肾小管修复的机制，尤其分子调控机制目前尚远不清楚。近来发现细胞周期G2/M检测点为影响肾小管修复的关键调控靶点；促进细胞周期由G2期进入M期将有利于肾损伤后的正常修复，反之，G2/M期停滞将使修复过度肾脏纤维化致慢性进展性肾脏病。我们前期研究首次发现RGC-32为G2/M检测点关键调控分子参与了肾小管修复过程，但其调控G2/M检测点的分子机制有待阐明。为此本研究拟通过急性肾损伤小鼠模型、RGC-32基因剔除小鼠、体外细胞培养，采用基因克隆、RNAi、分子生物学、组织细胞化学、免疫共沉淀、流式细胞、激光共聚焦等技术，了解RGC-32在肾小管修复过程中的作用及意义，明确RGC-32对细胞周期调控的可能机制，以及RGC-32通过G2/M检测点调控肾小管修复的分子机制。为阐明肾小管修复的分子机制以及肾损伤的靶向治疗提供理论依据。

急性肾损伤（ AKI）是临床常见的危重症,其发病率及死亡率较高.AKI时，肾小管上皮细胞为主要受损细胞，同时也是肾脏损伤后再生修复最主要的细胞来源。因此，肾小管上皮细胞重塑在AKI发生发展、预后转归中起着至关重要的作用。肾小管修复过程中细胞周期循环，尤其G2/M期作为关键调控周期参与了肾小管损伤修复过程。前期工作发现RGC-32参与了肾小管损伤、修复过程，且RGC-32也是细胞周期G2/M检测点关键调控分子，细胞顺利通过G2/M期进入下一个细胞周期必须依赖RGC-32磷酸化。RGC-32是否通过G2/M期检测点调控AKI后肾小管上皮细胞的再生修复及其分子机制目前仍不清楚。因此进行了本研究，结果发现：.一, RGC-32 在肾小管修复过程中的作用以及与细胞周期的关系：.（一）通过建立大鼠急性缺血缺氧再灌注肾损伤模型（AIKI）：（1）缺血再灌注后，RGC-32于再灌注后24h-72h表达水平明显降低。（2）缺血再灌注后2 h至72 h肾组织中处于M期的肾小管上皮细胞明显增多。（3） 给予AIKI大鼠TAX（G2/M期阻滞剂）使肾小管上皮细胞G2/M期停滞，可使大鼠肾损伤程度加重，且可能使相关致纤维化因子表达增加；给予AIKI大鼠PIF（G2/M期促进剂）可能通过促进肾小管上皮细胞通过G2/M期，从而使AIKI大鼠肾损伤程度减轻，并可能抑制相关致纤维化因子表达。 .（二）体外培养大鼠肾小管上皮细胞基础上，采用RNAi 技术低表达 RGC-32 基因，然后予 TNF-α 诱导肾小管损伤后修复细胞模型。RGC-32敲低后G2/M期比例明显增多，细胞损伤标志物NGAL、KIM-1及细胞外基质α-SMA、Fibronectin表达明显增高。.二、 RGC-32 影响肾小管修复的直接作用和可能机制.（一）利用RGC-32基因敲除小鼠分别制备AIKI、AAN、UUO肾损伤模型观察肾功能、肾脏组织形态学、G2/M期的变化情况。发现RGC32作为主要G2/M期调控分子参与了AKI肾小管修复过程。.（二）应用iTRAQ技术对野生型和RGC-32敲除小鼠的肾脏蛋白进行了蛋白组学分析， RGC-32敲除后肾脏蛋白质有361个蛋白表达有差异，表达差异蛋白质中Smad2-3、DNA-PK、SMC3参与细胞周期调节。进一步发现RGC32调控G2/M期的分子机制。

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