锌指蛋白ZBTB20对行为昼夜节律的调节作用及其机制研究

The mammals exhibit circadian rhythm in behavior and physiological processes. The hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN) functions as a central circadian pacemaker, which is capable of adaptation to external light change by intercellular coupling and synchronizing core circadian oscillators. SCN neurons project to the target region with some relevant secretory proteins as the signals of circadian outputs, the underlying mechanisms remain poorly defined. The zinc finger protein ZBTB20, originally identified by the applicant, is implicated to have a potential role in the regulation of behavioral circadian rhythm according to our preliminary data. Specific deletion of ZBTB20 in nervous system led to a dramatic alteration of behavioral rhythm, with the evening locomotor activity impaired in the early phase but bursted in the late phase. The phenotypes are quite similar to that of Prokr2-deficent mice. Interestingly, Prokr2 expression was decreased in SCN from ZBTB20 mutant mice. With these preliminary data in hand, we proposed to investigate the cellular and molecular mechanisms by which ZBTB20 regulates circadian rhythm, and to validate whether Prokr2 is a critical target of ZBTB20 in circadian rhythm. Our research will broaden our knowledge about the regulatory network of circadian rhythm.

昼夜节律是哺乳动物行为与生理活动的基本特征。下丘脑视交叉上核（SCN）作为生物节律的起搏点，能响应外界光线变化，经细胞间的内部偶联、形成同步化的生物钟振荡，通过输出信号作用于下级神经元，从而在昼夜节律的调节中发挥中心作用。SCN可产生多种分泌性蛋白（如前动力蛋白Prok2），参与昼夜节律的信号输出；相关的调节机制尚不清楚。锌指蛋白ZBTB20是申请人自主发现的新分子，前期研究发现，该基因的神经系统特异性基因敲除小鼠自发活动的节律发生明显改变，表现为夜间活动的早期相受损和晚期相异常增强，与Prokr2缺陷小鼠类似；同时发现该小鼠SCN区的Prokr2表达下调。本课题拟在此基础上，通过行为学、组织学、细胞学与分子生物学等实验技术，深入研究神经系统中ZBTB20调节行为节律的细胞与分子学基础，明确靶基因Prokr2在ZBTB20调节行为节律中的地位，丰富人们对SCN节律调节网络的认识。

昼夜节律是哺乳动物行为与生理活动的基本特征。下丘脑视交叉上核（SCN）作为生物节律的起搏点，能响应外界光线变化，经细胞间的内部偶联、形成同步化的生物钟振荡，通过输出信号作用于下级神经元，从而在昼夜节律的调节中发挥中心作用。SCN可产生多种分泌性蛋白（如前动力蛋白Prok2），参与昼夜节律的信号输出；相关的调节机制尚不清楚。锌指蛋白ZBTB20是申请人自主发现的新分子，该研究发现在神经系统特异性敲除Zbtb20基因导致小鼠自发活动的节律发生明显改变，表现为夜间活动的早期相受损和晚期相异常增强，与Prokr2缺陷小鼠类似；同时发现该小鼠SCN区的Prokr2表达下调，Prokr2神经元明显减少。在SCN脑区注射表达Prokr2的AAV，可部分回补夜间活动早期相减少的表型；利用FoxG1-Cre工具鼠，在端脑、中脑和后脑连接部、嗅球敲除ZBTB20而下丘脑ZBTB20仍然保留的条件敲除小鼠，结果发现其代谢和活动与对照小鼠相比，并没有显著异常，从而提示NS-ZB20KO的代谢与活动表型可能反映了下丘脑ZBTB20对正常生物节律的生理调节作用。染色质免疫沉淀（ChIP）分析显示SCN及其投射区ZBTB20与靶基因启动子结合，体外ZBTB20过表达可促进Prokr2启动子的转录活性，且与乙酰化酶P300具有协同作用。该表明ZBTB20是SCN区Prokr2神经元产生和发育所必需的，参与节律中枢的信号整合与输出，在维持正常生物节律中发挥重要作用，首次揭示了SCN区Prokr2神经元分化发育的转录调控机制。. 为进一步研究Prokr2神经元中ZBTB20的生物学功能，利用CRISPR/Cas9技术Prokr2-Cre工具鼠，并利用荧光蛋白Td-Tomato报告系统进行了验证分析，结果显示在下丘脑和大脑皮层可见红色荧光，与Prokr2表达的生理特征相符，表明该工具鼠可用于Prokr2神经元的示踪分析，为后续深入分析ZBTB20对Prokr2神经元发育和功能的影响提供了技术手段。

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