Omi/HtrA2促凋亡方式在不同肝癌细胞系中呈现差异性作用的机制研究

Primary hepatocellular carcinoma is a highly malignant tumor with the characteristics of rapid progression and poor prognosis.Transcatheter arterial chemoembolizatian (TACE) is the main treatment for the patients with unresectable hepatocellular carcinoma, but the therapeutic efficacy for the different patients has striking differences. The reason that TACE resulted in the different therapeutic efficay for patients with hepatocellular carcinoma remains unclear.Studies demonstrated that hypoxia-inducible factor-1 alpha(HIF-1α) overexpressed in hepatocellular carcinoma tissues after TACE therapy, while hepatocellular carcinoma tissues displayed weak for Omi/HtrA2. The latter not only participates in the process of hepatocellular carcinoma cell apoptosis, but also may play an important role in hepatocellular carcinoma cell proliferation, invasion, recurrence and metastasis. In our preliminary experiment, we observed that, in PLC cells the only way that Omi/HtrA2 participated in cell death was dependent on IAP-binding, and Omi/HtrA2 inducing HepG2 cell apoptosis mainly depended on its serine protease activity while both IAP-binding and its serine protease activity participated in Hep3B cell apoptosis. This result showed that Omi/HtrA2 proapoptotic manner was different in the different hepatocellular carcinoma cell lines. Then, whether this difference is the cause of the different therapeutic efficacy of TACE? Therefore, this study aims to use the methods of independently regulating the serine protein activity or caspase-dependent pathway to investigate the role and mechanisms of Omi/HtrA2 proapoptotic manner in the different hepatocellular carcinoma cell lines. This study will provide the strong theoretical and experimental basis for molecular targeting therapy to Omi/HtrA2 in hepatocellular carcinoma.

原发性肝癌发展快、预后差。肝动脉化疗栓塞（TACE）是不能切除肝癌主要治疗方法，但各个病人的疗效差异显著。其机制仍不十分清楚。研究发现TACE术后缺氧诱导因子-1α升高，而促凋亡因子Omi/HtrA2降低。后者参与肝癌细胞凋亡过程，且可能对肝癌细胞增殖、复发及转移发挥作用。我们前期研究发现Omi/HtrA2促凋亡方式在不同肝癌细胞系中存在差异：在肝癌细胞系PLC中Omi/HtrA2丝氨酸蛋白酶活性未参与凋亡过程，只有caspase依赖途径起作用；在肝癌细胞系HepG2、Hep3B中其丝氨酸蛋白酶活性均参与凋亡过程，但参与程度有显著差别。这一差异性是否是TACE疗效不同的原因呢？因此，本研究分别建立调控Omi/HtrA2丝氨酸蛋白酶活性途径和其依赖caspase途径的模型，阐明Omi/HtrA2促凋亡方式在不同肝癌细胞系中的作用及机制，为利用Omi/HtrA2开展靶向性治疗肝癌提供理论依据。

我们前期研究发现Omi/HtrA2不同促凋亡方式在肝癌细胞系HepG2、Hep3B、PLC中参与方式与程度存在差异，但机制不明。因此，本研究分别建立调控Omi/HtrA2不同促凋亡方式模型，探讨Omi/HtrA2不同促凋亡方式在不同肝癌细胞系中呈现差异性作用机制。首先建立Omi/HtrA2 不同促凋亡方式（单一表达Omi/HtrA2 丝氨酸蛋白酶活性途径、单一表达Omi/HtrA2 依赖Caspase 途径、同时表达Omi/HtrA2 依赖Caspase 途径和自身丝氨酸蛋白酶活性途径）在不同肝癌细胞系（HepG2、Hep3B、PLC）中的细胞表达模型，并建立相应的裸鼠动物实验模型，从细胞水平和动物模型层面上检测Omi/HtrA2 不同促凋亡方式在不同肝癌细胞系中对癌细胞凋亡、增殖、侵袭、复发和转移的影响及相关分子的表达。研究发现：HepG2和Hep3B细胞在转染了不同促凋亡方式的Omi/HtrA2 表达载体后，转染组细胞凋亡率明显高于正常对照组，细胞内的凋亡小体也较对照组多。但是PLC 细胞在转染不同促凋亡方式的Omi/HtrA2 表达载体后，细胞凋亡情况并未见明显变化。Pea-15和HAX-1在不同肝癌细胞系中，在Omi/HtrA2不同促凋亡方式影响下，呈负向调控趋势。HepG2细胞在转染了只有丝氨酸蛋白酶活性Omi/HtrA2表达载体后，细胞活力明显下降，Hep3B细胞在转染了不同促凋亡方式的Omi/HtrA2 表达载体后，细胞活力均表现出显著下降，PLC细胞活力无改变，细胞克隆，细胞侵袭检测提示HepG2、Hep3B、PLC无变化。Twist、MMP-9、MMP-2在不同肝癌细胞系中，在Omi/HtrA2不同促凋亡方式影响下，表达出现差异，而这些差异与细胞侵袭检测无变化相矛盾。这些实验结果表明：Omi/HtrA2 不同促凋亡方式对肝癌细胞系HepG2、Hep3B、PLC细胞凋亡产生显著差异性影响，可能是Pea-15和HAX-1负向调控导致；Omi/HtrA2 不同促凋亡方式明显降低了HepG2、Hep3B、PLC细胞活力，但对细胞克隆，细胞侵袭无明显影响，且Twist、MMP-9、MMP-2表达差异未能合理解释细胞侵袭无变化现象。本研究结论表明Pea-15和HAX-1负向调控可能是Omi/HtrA2 不同促凋亡方式在不同肝癌细胞系中呈现差异性作用的分子基础，

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