基于SMN2基因启动子区激活的脊髓性肌萎缩症干预研究

Spinal muscular atrophy (SMA) is a frequently fatal neurogenic disorder caused by a genetic defect in the survival motor neuron (SMN) gene. In humans, SMN gene has 2 nearly identical forms, SMN1 and SMN2. Most cases of SMA result from homozygous deletions of the SMN1 gene. An alternative splicing event in the pre-mRNA arising from SMN2 results in the production of low levels of full-length SMN protein. Therefore, the main strategies to treat SMA focus on increasing the expression of full-length SMN. Recently, some progresses have been made in the treatment of SMA. However, some present limitations, such as the difficulty of administration routes and no clear consensus for their efficacy, raise demands for new therapeutic approaches. In our preliminary studies, we have established the cell line of SMA patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) and differentiated them into motor neurons. Moreover, we have also established the mouse model of Type I SMA. Base on the good basis of our preliminary studies, we plan to design sgRNAs targeting the transcriptional regulatory regions of SMN2. Subsequently, we will use CRISPR-dCas9 system to recruit transcription activator (VP64, p65, Rta and so on) binding the SMN2 region and further activate SMN2 in iPSCs and SMA models. We will evaluate the efficacy of this therapeutic strategy by testing the SMN protein expression, motor neuron function and mouse behavior.

脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种高度致死、致残的神经遗传病，其致病基因运动神经元生存基因（SMN）具有SMN1、SMN2两种拷贝，绝大多数SMA患者发生了SMN1基因缺失突变而SMN2基因正常，但SMN2在mRNA剪接过程中出现7号外显子跳跃，导致产生的全长蛋白不足而致病。提高全长SMN蛋白的表达是本病治疗的主要策略。虽然近年来本病在治疗研究方面取得了一定的进展，但存在给药方式困难、临床疗效不确切等问题，亟需探索新的治疗手段。我们前期建立了SMA患者来源的ips细胞系，定向分化获得了运动神经元，同时建立了Ⅰ型SMA小鼠模型。本项目将立足于良好的前期基础，设计特异性靶向SMN2转录调控区的sgRNA，应用dCas9系统募集VP64、p65、Rta等转录激活因子，分别在ips及SMA小鼠水平对SMN2基因进行激活，从SMN蛋白表达、运动神经元功能以及小鼠行为学等方面探讨其对SMA治疗的可行性。

本项目在前期研究基础上，开展了如下系列研究：1、从临床诊断方面出发，持续开展SMA患者的诊疗，鉴定了SMN1基因6号内含子点突变c.835-5T > G导致mRNA剪接过程中丢失了7号外显子造成全长SMN蛋白缺失，为SMA罕见突变，拓宽了SMA的基因突变谱，为患者提供明确的产前诊断咨询依据。2、在临床队列来源的24个SMA患者和细胞库中3个SMA来源样本中，开展MLPA及ddPCR对SMN1及SMN2拷贝数检测的可重复性比较，结果表明ddPCR较MLPA有更高的特异性和可重复性，为SMA诊断提供了更好的技术手段。3、建立了dCas9-suntag-P65-HSF1激活系统，在SMN2基因5’UTR区域实现对SMN2全长及截短转录本的转录激活。4、采用CRISPR/Cas9系统破坏SMN2基因ISS-N1和ISS+100在体外细胞中提高SMN蛋白表达量，同时对SMA I型小鼠受精卵进行编辑，编辑后小鼠的生存期、体重、翻正反射、握力得到显著的改善，SMN全长mRNA及蛋白表达量提升，脊髓前角运动神经元中SMN蛋白功能复合体显著增加，神经-肌肉支配得到改善。该研究从概念上证明应用CRISPR/Cas9对SMA基因治疗可行性。5、采用高保真的腺嘌呤单碱基编辑系统（ABE）对SMN2基因7号外显子剪接沉默子进行编辑，成功编辑后的iPS全长SMN2 mRNA水平显著增高，其分化来源的运动神经元的功能性SMN蛋白颗粒增多；胚胎治疗后的SC-SMAT5C小鼠生存期、体重等均显著改善；对SMA-iPS细胞分化后脊髓前角运动神经元和新生小鼠（P0）的皮层注射质粒后电转，证实体内外神经元都能被ABE有效编辑。该研究采用的不切割DNA双链的单碱基编辑工具，较CRISPR/Cas9编辑方法进一步提高了安全性，将作为SMA成体治疗的核心研究方案。6、对其他神经遗传性疾病，如特发性基底节钙化、遗传性痉挛性截瘫等进行了基因突变分析，发现了若干新的突变位点，总结了临床表型-基因型关系。上述系列研究结果在SMA基因治疗研究上拨开云雾见月明，无论是基因编辑工具还是编辑位点的选择上都已明确，课题组目前正进一步开展SMA小鼠的成体治疗研究中，有望将该治疗方法实现临床应用转化。本系列研究已发表论文14篇，申请人于2018年入选福建省特殊支持“双百计划”人才，培养了6名博士研究生及4名硕士研究生。

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