海鞘细胞体外培养、基因转染及诱导多能干细胞的研究

SV40是研究瘤的转化和调节细胞周期非常好的多瘤病毒家族致癌基因，SV40 LT进入细胞后与p53和pRB 抑癌基因蛋白结合并使它们失活以及端粒酶逆转录酶的激活使细胞获得永恒生长起重要作用。而转录因子KlF4, OCt4, SOx2, c-MyC 在细胞内表达并进行重排、使其成为诱导产生的多能干细胞，进一步筛选并培养细胞获得细胞株。由于在海洋无脊椎动物中极少报导转染SV40抗原和四个转录因子研究细胞培养及建细胞系的相关研究，所以利用介于脊椎和无脊椎动物的海鞘为研究动物进行原代培养、优化培养基和培养条件。利用SV40、TERT、H-ras和四个转录因子构建逆转录病毒载体转染293T细胞包装逆转录病毒颗粒感染海鞘原代细胞，筛选阳性细胞和多能干细胞，进行裸鼠体内成瘤实验，研究细胞周期DNA复制、细胞分裂增殖与分化并培养永生化细胞，为海洋无脊椎经济动物建细胞系提供新的方法奠定基础和理论依据。

海鞘属于尾索动物亚门，是典型的被囊类动物。作为无脊椎动物中进化地位较高等的一类动物，海鞘在免疫、胚胎发育、细胞学等各个领域对研究脊椎动物的系统发生都有着非常重要的作用。. 实验室人工养殖海鞘的胚胎发育；海鞘的血细胞和性腺组织细胞为材料，建立和优化海鞘细胞体外培养方法和条件，结果表明，20℃，pH6.8，M199基础培养基添加10%胎牛血清最适合海鞘性腺组织细胞生长，而海鞘血细胞的培养，20℃，pH6.8条件下，L-15基础培养基并添加10%胎牛血清对血细胞的体外存活和生长效果较好；识别了成体海鞘性腺内的生殖样干细胞，并对其进行了体外培养和鉴定。结果表明，成体海鞘性腺内存在生殖样干细胞，且在体外可以生长，繁殖并且可能具有分化潜能。体外培养的过程中，生长的细胞克隆明显具有类似胚胎干细胞的形态和基因表达特点；海鞘细胞培养中细菌污染的鉴定和控制方法。对于培养过程中的细菌污染，通过细菌分离、培养发现两类菌株检出率较高，均为革兰氏阴性菌。经PCR 扩增16S rDNA 基因序列片断，结果显示这两类菌株分别属于弧菌属和施万氏菌属。在氯霉素和亚胺培南与双抗的抗生素组合有较好的抑菌效果并对培养细胞的贴壁和生长没有影响；转染转录因子SV40 LT 抗原、海鞘TERT 或人hTERT 基因使海鞘细胞永生化研究及转染Klf4,Oct4,Sox2,c-Myc基因探索诱导多能肝细胞的研究，为进一步开展海鞘细胞体外培养最终建立细胞系提供理论基础。总之，我们筛选到了适合海鞘性腺组织细胞和血细胞生长的培养基，并成功的将这两类细胞在体外进行了原代培养，并且虽然细胞传代未获成功，但为今后继续深入开展海鞘细胞培养研究奠定了基础，另外，海鞘生殖样干细胞的识别和培养也将为海洋无脊椎动物的细胞培养提供一条新途径。

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