伏隔核miR-29/Dnmt3/Meg3通路参与甲基苯丙胺成瘾的机制研究

Persistent changes in behavior and psychological function that occur in addicts are thought to be due to the structural and functional plasticity of neurons and synapses in the nucleus accumbens (NAc) yet the underlying mechanism remains unclear. Our previous studies suggested that miR-29/Dnmt3/Meg3 pathway may involved in methamphetamine (METH) addiction. Therefore, we aim to examine the effects of miR-29/Dnmt3/Meg3 pathway on METH-induced behavior sensitization and the underlying mechanism in the current study to further elucidate the neurobiological mechanisms of methamphetamine addiction. Firstly, we examine the changes of miR-29, Dnmt3, Meg3, Dlk1 and Notch1 in the NAc of METH-sensitized mice using RT-PCR, Western blot, and bisulfite sequencing. We then conduct miR-29, Dnmt3 and Meg3 overexpression and knockdown mice and neuronal primary culture receptively by microinjection or cell transfection of related lentivirus. Transmission electron microscope (TEM) and patch clamping technique are then used to examine the effects of miR-29/Dnmt3/Meg3 pathway as well as its downstream target gene (Dlk1) and signal pathway (Notch) on METH-induced structural plasticity and synaptic plasticity.

伏隔核神经元结构和功能可塑性改变是毒品成瘾的重要生物学基础，但其确切的机制尚不清楚，我们前期的研究结果提示，miR-29/Dnmt3/Meg3通路在此过程中可能参与了重要作用，因此，本研究拟利用慢病毒核团注射技术，建立相关分子过表达及表达抑制的甲基苯丙胺（METH）行为敏化小鼠模型，同时应用METH干预原代中脑神经元，采用RT-PCR、Western blot、重亚硫酸盐测序等分子生物学研究方法以及透射电镜、膜片钳等形态学和电生理研究手段，系统观察伏隔核以及培养细胞中miR-29、Dnmt3、Meg3的表达和可塑性改变及其对Meg3的靶基因Dlk1的影响，分析miR-29、Dnmt3、Meg3之间的相互作用，进一步探讨miR-29/Dnmt3/Meg3通路通过调节Dlk1并作用于Notch信号通路在METH诱导的行为敏化过程中的作用机制，为进一步揭示METH成瘾的神经生物学机制奠定基础。

本项目主要在高通量测序技术获得的甲基苯丙胺（methamphetamine,METH）成瘾小鼠伏隔核（nucleus accumbens,NAc）中microRNA-mRNA表达网络的基础上，利用腺相关病毒介导过表达或表达抑制载体以及脑立体定位技术，在动物水平上证明了miR-29c、miR-128在NAc中上调/下调能够显著增强或抑制METH行为敏化，Notch1在前额叶皮质（prefrontal cortex,PFC）中上调/下调也能够显著增强或抑制METH行为敏化。明确了Dnmt3a/b、Meg3参与miR-29c调控METH成瘾，而GABAB1受体参与Notch1对METH成瘾的调控;利用iTRAQ技术获得了miR-29c、miR-128调控METH成瘾的蛋白表达网络，发现miR-29c、miR-128调控METH成瘾的其他神经可塑性信号分子。针对大量microRNA在METH作用下表达下降这一现象，本研究还发现了microRNA生物合成相关蛋白Ago2在NAc神经元中上调/下调能够显著抑制或增强METH行为敏化，并发现miR-3068可能是NAc神经元中Ago2依赖microRNA，对METH行为敏化具有调控作用。研究结果为METH成瘾机制及防治研究提供了新思路和新靶点。项目原计划目标全部完成：发表SCI论文16篇，其中具有影响力论文5篇，国内核心期刊论文1篇；为本学科培养青年学术骨干3名，博士研究生6名，硕士研究生3名；在研期间邀请2名国外本领域的知名专家指导交流，并合作发表SCI论文4篇；选派1名博士研究生前往新加坡国立大学-美国杜克大学医学院神经科学与行为障碍学系进行为期一年的联合培养。通过本项目研究工作的实施，课题研究团队之间的协同促进作用得到明显加强，研究能力和水平进一步得到提升，为深入研究药物依赖机制及其防治打下坚实基础。

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