锌和铁对大肠杆菌TopA和人类Top3A拓扑异构酶活性的调节机制研究

大肠杆菌TopA和人类Top3A同属于拓扑异构酶IA家族，可以催化双链DNA负超螺旋结构中单链的断裂和再连接反应而改变其拓扑状态。以往研究认为锌对大肠杆菌TopA特异性结合是产生拓扑异构酶活性的必需条件。我们发现大肠杆菌TopA在体内不仅能结合锌，也能结合铁，而且铁结合形式的蛋白无拓扑异构酶活性。本研究在此基础上提出大肠杆菌TopA功能的假说：大肠杆菌TopA拓扑异构酶活性受到特异性结合位点上锌和铁结合形式的调节；并且人类Top3A也可能具有相似特征。并将从以下三方面证明这个假设：1）分析大肠杆菌TopA锌结合域的三个锌特异结合位点之间存在对锌和铁结合活性的差异。2）分析三个锌特异性结合位点的锌和铁结合形式与拓扑异构酶活性之间的关系。3）探究人类Top3A对锌和铁结合活性及其和拓扑异构酶活性的关系。这些研究结果将为开发新型抗生素和对人体铁锌代谢和疾病相关性的研究奠定基础。

大肠杆菌TopA和人类Top3A都属于拓扑异构酶IA家族，可以催化双链DNA负超螺旋结构中单链的断裂和再连接反应而维持其拓扑状态。我们在前期工作中发现大肠杆菌TopA 在体内不仅能结合锌，也能结合铁，而且铁结合形式的蛋白无拓扑异构酶活性。本课题中我们发现没有活性的铁结合的大肠杆菌TopA在还原条件下可以恢复其活性，证明铁结合大肠杆菌TopA的活性受到氧化还原的调节。进一步发现一个铁原子可以同时通过第一个和第二个锌指结构与单位分子的大肠杆菌TopA蛋白结合，并且第一个和第二个锌指结构对铁结合大肠杆菌TopA都是必需的，而第三个锌指结构并不参与铁结合。通过定点突变技术我们发现第一个和第二个锌指结构的突变可以显著降低大肠杆菌TopA的酶活性，而第三个锌指结构突变对其影响不大，说明前面两个锌指结构对大肠杆菌TopA的活性是非常关键的。DNA结合活性实验和内源性荧光测定表明铁结合大肠杆菌TopA可以使其锌指结构的单链DNA结合能力显著下降，并且能够改变蛋白的空间构象，从而抑制了其拓扑异构酶活性。我们还发现大肠杆菌拓扑异构酶I是否具有完整的拓扑异构酶活性与结合的金属种类无关，而可能与结合的金属数目有关。此外，我们也对人类Top3A的铁、锌结合活性进行了探索，发现人类Top3A的锌指结构不仅能够结合锌，也能结合铁或者铁硫簇，提示其活性可能也受到锌或者铁/铁硫簇的调节，其具体机制有待进一步研究。最后，我们发现大肠杆菌一个功能未知的蛋白YrdD，它与大肠杆菌TopA锌指结构具有很高的同源性，不仅可以结合锌，也能够结合铁。并且锌结合的YrdD具有很强的单链DNA结合能力，而铁结合的YrdD对单链DNA结合能力明显减弱。有趣的是，锌结合形式的YrdD结合单链DNA后，能够有效防止单链DNA被DNA酶降解，说明YrdD对单链DNA具有一定的保护作用。总之，以上研究系统性地阐明了铁和锌对大肠杆菌TopA的调节机制，初步提供了铁和锌能够对人类Top3A进行调节的线索，还发现了功能未知蛋白YrdD的潜在功能。这些研究可能为针对选择性药物作用靶点的拓扑异构酶抑制剂等抗生素的研发提供有价值的线索。本课题研究内容已发表Protein Science论文1篇，Biometals论文1篇。

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