基于"逆向免疫学"理论筛选具有高度交叉保护能力的猪抗口蹄疫病毒的抗原表位

本项目在原工作基础上，根据"逆向免疫学"理论，通过构建猪抗体的噬菌体展示文库，筛选对不同型的口蹄疫病毒有高度交叉保护能力的抗原表位。首先用不同型的口蹄疫病毒免疫猪，分离猪外周血淋巴细胞,提取总mRNA,逆转录获得cDNA，以猪源抗体IgG 基因的引物扩增轻、重链基因，并克隆到pComb3H 噬菌粒中，转化XL-1菌，构建噬菌体抗体库。然后每轮使用不同型的FMDV的病毒粒子与抗体文库杂交，通过4-5轮的顺序性抗原结合（SAP）方法筛选高效、交叉反应的单抗。接着将交叉反应的单抗与病毒粒子或VP1等蛋白混合结晶，用X-晶体衍射技术确定结合在抗体上的线性或非线性表位序列。同时，通过细胞上的病毒中和试验和本体动物保护试验，功能上鉴定能与不同型的FMDV有中和作用的交叉保护性的单抗，从而确定诱导交叉保护能力抗体的抗原表位。该工作为研究广谱、高效、具有交叉保护功能的抗口蹄疫病毒疫苗奠定基础。

本项目的目标是通过构建猪抗体基因文库来筛选对不同型口蹄疫病毒有交叉保护作用的中和抗体的抗原表位，其中拟解决的关键科学问题是：构建猪的单克隆抗体库，用SAP方法（序列性抗原筛选技术，Sequential Antigen Panning，SAP）筛选有交叉保护作用的单抗。目前我们完成了：1、通过对家猪进行O型、AsiaⅠ型口蹄疫病毒的攻击以及用A型灭活疫苗免疫的长达49天的免疫实验，我们获得了对3种不同型的口蹄疫病毒免疫应答的本体动物，并通过分离其外周血淋巴细胞，RNA抽提、RT-PCR扩增获得了高丰度的抗体基因；2、用pComb3xss载体系统构建了噬菌体展示的基因工程抗体文库（目前库容105）；3、根据序列性抗原筛选技术（sequential antigen panning , SAP），用O型及AsiaⅠ型口蹄疫病毒146s病毒颗粒筛选到了2个单克隆抗体表达菌；4、在E.coli中表达、纯化了其中的一个单克隆抗体；5、通过ELISA实验初步确定该单克隆抗体能够与O型口蹄疫病毒抗原颗粒结合，今后可以进一步确定二者的结合位点；6、考虑到B细胞表位不仅有构象表位还有线性表位存在，而且现有的多肽疫苗表位主要是利用线性表位，所以我们还构建了3种病毒型（Ｏ型、AsiaⅠ型和 A 型）的主要抗原结构蛋白VP1，并纯化得到了大量的O型口蹄疫病毒的外壳蛋白（VP1蛋白）用于抗体库的筛选；７、为了更便捷地鉴定与抗体结合的主要抗原VP1上的具体氨基酸，我们针对本实验的O型毒株的VP1全序列（213aa）构建了18肽肽库（21个克隆），通过Western blotting技术可以确定阳性ScFV单抗与VP1结合的肽段，进而可以通过系列8肽确定其最小结合基序（motif），这将为X射线晶体衍射方法确定抗原-抗体结合位点提供了充分的保障。

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