十字花科黑腐病菌全局性转录调控因子HpaR1与Clp共同调控致病生化因子表达之模式研究

Knowledge about the bacterial pathogens produce series of virulence factors, e. g. extracellular polysaccharide, extracellular enzymes and type III secretion system effectors, in the process of invading host-plant is poor. It is well known that the transcriptional regulators sense the environmental or intracellular signals and then regulate the expression of the target genes. A number of genes have been shown to be control by more than 2 transcriptional regulators via binding directly to the promoters, indicating that these promoters can integrate difference signals into the output via the transcriptional regulators. The Gram-negative bacterium Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), the causal agent of the black rot disease in cruciferous plant, is a model organism for exploring the interaction of Plant-Microbe. In previous work, we have identified that the binding of the global regulators HpaR1 and Clp in Xcc to the promoter of gum and engXCA genes, which related to the production of extracellular polysaccharide and extracellular endoglucanase, respectively. Moreover, the predicted binding sites of HpaR1/Clp on the target promoters are special, implying the mechanism for the HpaR1/Clp co-regulation is differ from those of the 4 characterized models. Here, we will explore the mechanisms of HpaR1/Clp on the regulation of gum and engXCA genes by using the methods/techniques of molecular biology, proteomics and structure biology. This project will give us more understanding about the sophisticated mechanism of gene expression and regulation, as well as the mechanism about the producing of bacterial virulence factors in the process of causing disease.

胞外多糖、胞外酶、III型效应蛋白等致病生化因子在病原菌侵染寄主过程中起不同的作用。目前人们对病原菌致病过程中致病生化因子产生的机理了解非常有限。细菌的转录调控因子能够通过感受环境信号，来精确调控基因的表达。单个基因受两个或两个以上转录因子调控，则表明该基因能够响应多种环境信号。我们前期工作发现，十字花科黑腐病菌转录因子HpaR1和Clp均能结合在胞外多糖、胞外酶产生的相关基因gum、engXCA等的启动子上,正调控胞外多糖和胞外酶的产生；而且，HpaR1和Clp在gum、engXCA启动子上的结合位置特殊，表明HpaR1和Clp可能以新的“双转录因子共同正调控”模式来调控靶基因的表达。本项目拟采用现代分子生物学技术，并结合蛋白质组学、结构生物学的方法和技术，来研究HpaR1和Clp共同调控胞外多糖和胞外酶产生的模式，以了解病原菌如何依据环境信号的变化，来精确调控致病生化因子的产生。

细菌的转录调控因子能够通过感受环境信号，来精确调控基因的表达。已知黄单胞菌属病原菌的胞外多糖、胞外酶、III型效应蛋白等致病生化因子的产生受一些转录因子的调控，但具体的调控机理尚未清楚。我们前期工作发现，十字花科黑腐病菌(Xcc)的两个全局性转录调控因子HpaR1和Clp均能结合在胞外多糖、胞外酶产生的相关基因gum、engXCA等的启动子上,正调控胞外多糖和胞外酶的产生。表明HpaR1和Clp可能以新的“双转录因子共同正调控”模式来调控靶基因的表达。本项目主要研究HpaR1和Clp共同调控靶基因表达的模式。.研究工作首先明确了HpaR1和Clp对靶基因engXCA/gum的启动子转录具有正调控作用。通过对HpaR1和Clp在靶基因启动子上的结合位点进行定位。发现Clp在engXCA/gum启动子上游有两个结合位点CBSI和CBSII，HpaR1只有一个结合位点HBS，且HBS和CBSII部分重叠。进一步分析，证明了HpaR1和Clp是通过竞争性地结合在engXCA/gum启动子上，来对engXCA/gum基因的表达水平进行精细调控。这是一种新的转录调控模式。.蛋白质组学技术分析发现，HpaR1和Clp存在相互作用。表明HpaR1和Clp可能还存在其它的调控模式，我们因此对hpaR1启动子以及糖苷水解酶基因ghy启动子进行研究。发现HpaR1和Clp能够结合在hpaR1/ghy启动子区，分别负调控和正调控hpaR1/ghy基因的表达。进一步的研究发现，HpaR1除了抑制靶基因的转录外，还能够通过蛋白质之间的相互作用，来抑制Clp对hpaR1/ghy基因的转录激活。.另外，HpaR1也能够与一些类核相关蛋白(NAPs)相互作用，暗示HpaR1也可能通过与其它NAPs的协作，来共同调控相关基因的表达。在本项目中，我们还对一些互作的NAPs蛋白，如Fis-like蛋白Flp、HU-like蛋白Hlp的功能进行分析，证实了这些蛋白参与调控病原菌的致病过程。.本项目原定的研究计划已经全部执行。目前已在国内外主流刊物发表研究论文7篇，综述1篇，另有1-2篇论文尚未整理。.通过本项目的研究，我们还发现了转录因子HpaR1和Clp均存在丝氨酸/苏氨酸位点被磷酸化的现象。这暗示我们，黄单胞菌的信号传导可能还存在转录因子的Ser/Thr磷酸化这一新方式。

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