腓骨肌萎缩症新致病基因的鉴定及功能研究

Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) is a common hereditary peripheral neuropathy, there are 41 genes are causative of the neuropathy. A previous study showed that a pedigree of autosomal dominant CMT was found no link to known autosomal dominant CMT-associated genes. Exome sequencing and Sanger sequencing indicated that this CMT pedigree was probably caused by a c. 329T>A (p. Ile110Asn) mutation in the C1orf194 gene with unknown function in our study. Aggregation of the p.Ile110Asn variant C1orf194 protein was found in a sural nerve biopsy from the proband. The variant C1orf194 protein may lead to misfolded and neurodegeneration, and finally to CMT. Based on previous research, this study aims to identify the c. 329T>A mutation in the C1orf194 gene responsible for autosomal dominant CMT in vitro and in vivo research. This study is also designed to explore what is the function of the C1orf194 protein, to explore how the c. 329T>A mutation can cause CMT in the C1orf194 gene. This study will provide a basis, which will be useful to understand genetic causes of CMT, it also characterizes the C1orf194 gene's function. Moreover, This study may contribute to the molecular therapy for CMT.

腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth, CMT）是常见的遗传性周围神经病，已发现的致病基因有41个。前期我们发现一个常染色体显性遗传CMT家系，连锁分析基本排除已知的致病基因位点。通过外显子组测序和Sanger测序提示该CMT家系可能是C1orf194基因的c. 329T>A (p. Ile110Asn) 突变所致；免疫组化显示先证者突变C1orf194蛋白在神经元内聚集，提示该突变可能通过突变蛋白的错误折叠进而导致神经退行性病变，产生CMT表现。C1orf194基因是一未知功能的基因。本研究将在前期研究基础上，通过体内外实验证实C1orf194基因为常染色体显性遗传CMT的致病基因，研究C1orf194蛋白的功能，并探讨C1orf194基因突变致CMT的分子机制。项目开展既能增加对CMT遗传基础的理解，又可探讨C1orf194基因的功能，甚至可为CMT分子治疗提供依据。

项目背景：腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth, CMT）是常见的遗传性周围神经病，临床表现和遗传均具异质性，已发现41个致病基因，仍有近30% CMT患者未能找到致病基因。这给临床诊断和产前诊断带来困难。我们在前期研究中发现一个C1ORF194基因p. I28 N突变的CMT家系，故申请了《腓骨肌萎缩症新致病基因的鉴定及功能研究》项目研究。.研究内容及结果：项目在临床研究部分通过中南大学湘雅医院找到了一个C1ORF194基因p.K28I突变所致CMT家系，验证了C1ORF194是CMT的新致病基因。在SH-SY5Y细胞内，C1orf194蛋白定位于胞浆，突变蛋白呈点状聚集，且降解速率比正常蛋白低，这与CMT患者胞浆内C1orf194蛋白聚集一致。在SH-SY5Y细胞内还发现C1orf194与GRP75蛋白存在相互作用，突变蛋白则失去这种相互作用。进一步研究发现C1orf194调控GRP75蛋白，C1ORF194基因突变导致线粒体和内质网间Ca2+运输障碍，引起胞浆内Ca2+升高，导致神经元坏死，这是引起CMT的分子机制。项目通过CRISPR/Cas9技术获得了C1orf194+/Ile121Asn突变鼠，4月龄通过悬尾、Rotarod、脚印及抓力等实验显示C1orf194+/Ile121Asn杂合和纯合鼠表现出类似人CMT症状。通过观察C1orf194+/Ile121Asn杂合和纯合鼠坐骨神经切片发现神经纤维排列不规则，部分神经纤维存在脱髓鞘或髓鞘折叠等改变，轴突与神经纤维面积比（g-ratio）较正常鼠下降，这些神经病理改变类似人CMT患者的神经病变。项目不仅证实了C1ORF194基因是CMT新致病基因，也对其致病机制进行了探讨。项目主要研究成果发表在《Brain》（IF=11.814）杂志上（2019, 142: 2215-2229）。.研究意义：项目首次发现C1ORF194是CMT新致病基因，拓展了CMT致病基因谱，增加了CMT临床诊断和产前诊断的准确性；项目还探讨了C1ORF194基因突变致CMT的分子机制，为治疗研究奠定了基础。C1orf194以前是一个未知功能蛋白，本项目发现其功能是调节GRP75蛋白，控制线粒体和内质网间Ca2+流，为进一步研究C1orf194蛋白结构与功能提供了依据。

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