L-苏氨酸醛缩酶催化合成β-羟基-α-氨基酸的β-碳立体选择性机理研究

Chiral β-hydroxy-α-amino acids are very important intermediates for the synthesis of pharmaceuticals. Effective methods have been continuously sought for the preparation of these highly valuable compounds. L-Threonine aldolase (L-TA) catalyzes the aldol reaction of aldehydes and glycine to produce β-hydroxy-α-amino acids in one-step, offering an attractive approach to access these compounds. While the enzyme has excellent stereocontrol at the α-carbon of the product β-hydroxy-α-amino acid, low or moderate stereoselectivity is often observed at the β-carbon. As such, the product is usually a mixture of two stereomers, limiting its synthetic application. We have obtained 10 L-threonine aldolases of different origins. The project will study the β-carbon stereoselectivity of these L-threonine aldolases toward different aldehyde substrates. Based on the structures of some L-TAs, mutagenesis and property studies in combination with molecular modeling and calculation will be employed to investigate the relationship between the structure of L-TA and β-carbon stereoselectivity, thus revealing the β-carbon stereocontrol mechanism of L-threonine aldolase. Based on these results, the L-TA will be rational designed and some mutant enzymes, which show high stereoselectivity at β-carbon, will be tested for the synthesis of some important β-hydroxy-α-amino acids.

手性β-羟基-α-氨基酸是很多药物合成的关键中间体，实现其高效手性合成一直是研究的热点之一。L-苏氨酸醛缩酶在温和反应条件下，催化甘氨酸和醛底物缩合，生成具有两个手性碳的β-羟基-α-氨基酸产物。产物α-碳的立体选择性能够得到绝对控制，但β-碳的立体选择性则往往不高，导致合成的产物为混合物形式，限制了L-苏氨酸醛缩酶在合成方面的应用。本项目以实验室已获得的L-苏氨酸醛缩酶作为研究对象，测试不同的反应底物生成产物β-碳的立体构型，以酶的晶体结构作为基础，获得底物分子、辅因子与酶分子相互作用信息，发现β-碳立体选择性控制的影响因素，对酶分子进行半理性设计，验证推测的β-碳立体选择性影响因素的正确性，从而解析L-苏氨酸醛缩酶对β-碳的立体选择性控制的机理，提高催化过程中产物β-碳的立体选择性。利用获得的有益突变体作为催化剂，合成高光学纯的β-羟基-α-氨基酸，为该酶的进一步研究和应用打下基础。

本项目开展了L-苏氨酸醛缩酶(LTA)催化合成β-羟基-α-氨基酸β-碳立体选择性机理研究。首先考察了18个不同来源的L-苏氨酸醛缩酶的底物谱情况，结果发现这18个不同来源的L-苏氨酸醛缩酶在底物谱方面虽各有特点，但均未对产物β-位取代基的立体选择性有良好的手性控制效果。根据底物谱的筛选结果选择来源于Pseudomonas sp.的Ps-LTA为研究对象进行了同源建模，为了实现该酶的高通量筛选，我们首次开发了唯一一个可以同时筛选L-苏氨酸醛缩酶活性和立体选择性的方法，这对LTA的定向进化是一个很大的促进。利用开发的高通量筛选方法，选了酶活性中心的10Å和15Å范围内的氨基酸进行饱和突变筛选，未取得有益突变体。随后选择同时突变与底物不同官能团相互作用的氨基酸的半理性设计策略，分别获得了活力提高、立体选择性提高、立体选择性翻转的突变体D93S/E147D、D93F/E147D、D93N/E147D。这些有益突变体在催化4-甲砜基苯甲醛与甘氨酸缩合时与野生型相比无明显变化，因此我们采取了随机突变策略：获得的突变体V200I 够催化4-甲砜基苯甲醛与甘氨酸缩合制备反应de值可以达到65%，突变体K116N/A120D/M284I分析产率可以达到80%。结构模拟表明突变位点116、120、200、284远离活性中心，突变结果表明了活性空腔外围的氨基酸残基位点会对酶的催化性能产生显著影响。本项目通过两种不同的改造策略获得了提高对β-碳立体选择提高的突变体，并对其提高立体选择性的机理进行了解析，利用获得的突变体进行了制备反应，通过本项目的实施为L-苏氨酸醛缩酶的进一步改造和应用打下了坚实的基础。

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