A Scalable Neuron-Based High-Throughput Screening Platform for the Discovery of Compounds that Restore Protein Expression Caused by Genetic Haploinsufficiency

一种可扩展的基于神经元的高通量筛选平台，用于发现可恢复由遗传单倍体不足引起的蛋白质表达的化合物

• 批准号: 9370360
• 负责人: GAVIN R RUMBAUGH
• 金额: $ 68.73万
• 依托单位: SCRIPPS FLORIDA
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2017-07-01 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/9370360
• 关键词: Academia; Alleles; Autistic Disorder; Biological; Biological Assay; Brain; Brain Diseases; Budgets; Chemicals; Childhood; Clinical; Development; Disease; Environment; Epilepsy; Evaluation; Fluorescence; Gene Targeting; Genetic; Goals; Hand; Human; Industrialization; Intellectual functioning disability; Knock-in Mouse; Lead; Libraries; Magic; Mind; Miniaturization; Modeling; Molecular; Mus; Nature; Neurons; Online Mendelian Inheritance In Man; Patients; Pharmaceutical Preparations; Phenotype; Plant Roots; Procedures; Process; Proteins; Reporter; Reporting; Reproducibility; Research; Robotics; Series; System; Systems Development; Testing; Therapeutic; Variant; Work; assay development; base; cost effective; design; disease phenotype; drug discovery; experimental study; flexibility; high throughput screening; improved; miniaturize; neuropsychiatric disorder; novel; protein expression; scale up; screening

PROJECT SUMMARY    Drug discovery pipelines for neuropsychiatric disorders are dry. One approach to rejuvenating these pipelines  would  be  to  create  assays  based  on  relevant  disease  phenotypes  in  primary  neurons,  something  that  is  currently  lacking.  However,  a  scalable  assay  development  platform  that  is  based  on  bona  fide  neurons,  remains  cost  effective,  and  that  can  support  industrial  level  HTS  does  not  currently  exist.  Over  the  past  five  years, our collaborative group has created a flexible and scalable primary neuron assay development system  that is compatible with industrial-­level HTS. Here, our goal is to optimize these procedures and workflows  to  determine  the  limit  of  scalability  of  neuron-­based  HTS  phenotypic  assays  so  that  they  can  easily  support very large campaigns of >200K compounds.    A  substantial  proportion  of  childhood  brain  disorders  are  caused  by  single  autosomal  dominant  variants  resulting in genetic haploinsufficiency. The rare genetic brain disorders that arise from these variants offer the  greatest potential for discovery of robust therapeutics because the disease mechanism is often straight forward  (i.e. low protein expression). Therefore, a rationale strategy to improve conditions in these patients would be to  treat  them  with  “magic  bullet”  compounds  that  raise  expression  of  functional  proteins  from  the  remaining  undamaged  allele  (e.g.  “boosting  compounds”).  De  novo  nonsense  variants  that  cause  SYNGAP1  haploinsufficiency  lead  to  a  genetically-­defined  form  of  intellectual  disability  with  autism  and  epilepsy  (MRD5;;  OMIM#603384)  that  may  explain  up  to  1-­2%  of  all  ID  cases.  The  accepted  cause  of  this  disorder  is  low  functional protein expression in neurons caused most often by truncating SYNGAP1 nonsense variants. As a  means to refine the neuron-­based HTS system, and to advance treatment for ASD-­related disorders, we  are  seeking  to  scale-­up  and  implement  an  assay  for  SynGAP  expression  that  is  compatible  with  industrial-­level robotics. In the first Aim, we will optimize an HTS-­compatible and disease-­relevant SynGAP  expression  assay.  This  assay  is  based  on  mouse  primary  neurons  where  tdTomato  fluorescence  reflects  steady-­state  endogenous  SynGAP  protein  levels.  In  the  second  aim,  we  will  miniaturize  the  SynGAP  expression assay to the 1536-­well format. This miniaturization process would enable an HTS-­scale screen of  this,  or  any  other  related  neuron-­based  phenotypic  assay,  of  up  to  400,000  culture  wells  using  a  standard  screening budget. Finally, we will implement the SynGAP expression assay in a true uHTS environment and  then  validate  lead  compounds  that  emerge  from  a  20K  compound  pilot  screen,  including  a  10K  compound  repurposing  screen  of  known  “safe  in  human”  compounds.  The  impact  of  this  project  that  we  expect  to  develop procedures that will increase the scale of HTS campaigns in neurons by 10-­fold or more relative to the  current state-­of-­the-­art in academic screening centers. We also expect to validate at least one lead compound  that boosts SynGAP expression, hopefully from the repurposing library.

项目概要   神经精神疾病的药物发现渠道枯竭，振兴这些渠道的一种方法。 将是根据原代神经元的相关疾病表型创建检测方法， 然而，目前缺乏基于真正神经元的可扩展检测开发平台。 仍然具有成本效益，并且在过去五年中目前不存在能够支持工业级高温超导的技术。 多年来，我们的合作小组创建了一个灵活且可扩展的初级神经元检测开发系统。 这与工业级 HTS 兼容。在这里，我们的目标是优化这些程序和工作流程。 确定基于神经元的 HTS 表型测定的可扩展性极限，以便他们可以轻松地 支持超过 200K 化合物的大型活动。 很大一部分儿童脑部疾病是由单一常染色体显性变异引起的 导致遗传单倍体不足的原因是这些变异引起的罕见遗传性脑部疾病。 发现强有力的治疗方法的最大潜力，因为疾病机制通常是简单的 （即低蛋白表达）因此，改善这些患者状况的基本策略是： 用“神奇的子弹”化合物治疗它们，这些化合物可以提高剩余的功能蛋白的表达 未受损的等位基因（例如“增强化合物”）。 单倍体不足会导致遗传性智力障碍，包括自闭症和癫痫症（MRD5；； OMIM#603384）这可以解释高达 1-2% 的 ID 病例，目前公认的导致这种疾病的原因较低。 神经元中的功能性蛋白质表达通常是由截断 SYNGAP1 无义变体引起的。 旨在完善基于神经元的 HTS 系统，并推进 ASD 相关疾病的治疗，我们 正在寻求扩大并实施与 SynGAP 检测表达兼容的方法 在第一个目标中，我们将优化 HTS 兼容且与疾病相关的 SynGAP。 表达测定 该测定基于小鼠原代神经元，其中 tdTomato 荧光反映 稳态内源 SynGAP 蛋白水平 在第二个目标中，我们将小型化 SynGAP。 1536 孔格式的表达测定。这种小型化过程将实现 HTS 规模的筛选 使用标准进行多达 400,000 个培养孔的这种或任何其他相关的基于神经元的表型测定。 最后，我们将在真正的 uHTS 环境中实施 SynGAP 表达测定。 然后验证从 20K 化合物试点筛选中出现的先导化合物，包括 10K 化合物 重新筛选已知的“对人体安全”的化合物 我们预计该项目的影响。 开发程序，将神经元中 HTS 活动的规模增加 10 倍或更多 我们还期望验证至少一种先导化合物。 增强 SynGAP 表达，希望来自重新利用的文库。