Rotavirus Genome Replication and Virion Assembly

轮状病毒基因组复制和病毒粒子组装

• 批准号: 10576929
• 负责人: Deborah F Kelly
• 金额: $ 45.82万
• 依托单位: WAKE FOREST UNIVERSITY
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2022-01-14 至 2027-01-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10576929
• 关键词: 2019-nCoV; 3-Dimensional; Antiviral Agents; Armadillo Repeat; Binding; Biochemical; Biological Assay; Biological Models; Cells; Child; Complex; Cryoelectron Microscopy; Data; Defect; Diarrhea; Disease; Double Stranded RNA Virus; Double-Stranded RNA; Drug Design; Ebola virus; Economic Burden; Engineering; Enzymes; Family; Foundations; Genetic Techniques; Genetic Transcription; Genome; Genomic Segment; Ice; Image; In Situ; In Vitro; Infection; Influenza A virus; Knowledge; Lesion; Life; Liquid substance; Mammalian Cell; Maps; Medical; Microfluidics; Mission; Molecular Conformation; N-terminal; Pathogenesis; Performance; Plasmids; Proteins; Publishing; RNA; RNA Viruses; RNA chemical synthesis; RNA-Directed RNA Polymerase; Recombinants; Regulation; Reoviridae; Research; Resolution; Rotavirus; Site; Societies; Structure; System; Techniques; Testing; Transcriptase; United States National Institutes of Health; Viral; Virion; Virus; Virus Replication; Virus-like particle; Work; flexibility; human disease; human pathogen; in vitro activity; insight; mutant; particle; prevent; public health relevance; rational design; reconstruction; replicase; reverse genetics; scaffold; structural biology; three dimensional structure; viral RNA

PROJECT SUMMARY/ABSTRACT (DESCRIPTION):    RNA viruses can be devastating human pathogens that impart large medical and economic burdens to society  (e.g.,  SARS-­CoV-­2,  influenza  A  virus,  Ebola  virus,  rotavirus,  etc.).  While  these  viruses  can  differ  quite  dramatically  in  their  pathogenesis,  they  share  a  common  replication  feature—they  must  synthesize  new  RNA  molecules from RNA templates. Because host cell enzymes lack this activity, RNA viruses encode a specialized  RNA-­dependent  RNA  polymerase  (RdRp).  Viral  RdRps  are  structurally-­  and  functionally-­conserved  among  diverse  RNA  viral  families,  and  they  directly  catalyze  all  stages  of  viral  transcription  and  genome  replication.  However, these enzymes rarely function alone in the context of infected cells. Instead, the viral RdRps are tightly  regulated  by  other proteins  in  multi-­subunit  transcriptase/replicase  complexes  so  as  to  maximize  the  type and  timing of viral RNA synthesis. The overall objective of this application is to gain mechanistic insight into RdRp  regulation for rotavirus—an 11-­segmented, double-­stranded (ds) RNA virus that causes life-­threatening diarrhea  in young children. The rotavirus VP1 RdRp functions only when bound beneath the icosahedral VP2 core shell  layer of intact, or partially intact, particles. Engagement of VP1 by VP2 during early particle assembly activates  the  RdRp  so  that  it  functions  as  a  replicase,  converting  packaged,  single-­stranded  positive  sense  (+)  RNA  templates  into  dsRNA  genome  segments.  Early  assembly  intermediates  then  morph  into  double-­layered  particles,  wherein  the  VP2-­bound,  VP1  RdRp  switches  to  a  transcriptase  activity,  synthesizing  +RNAs  using  dsRNA  templates.  Still,  major  gaps  in  knowledge  remain  about  the  structure  of  the  VP1  RdRp  as  a  replicase  during  dsRNA  synthesis  and  its  regulation  by  the  VP2  core  shell  protein.  Here,  well-­established  in  vitro  biochemical and genetic techniques are combined with state-­of-­the-­art structural approaches to close these gaps  in knowledge and inform a deep understanding of rotavirus RdRp regulation. AIM 1 will elucidate VP2 core shell  determinants critical for VP1 replicase activity, and AIM 2 will determine the first-­ever in situ 3D atomic structures  of VP1 as a replicase in both ice (using cryo-­EM) and liquid (using a microfluidics system). The work outlined in  this application is significant, as it is expected to reveal detailed structure-­function information about the rotavirus  RdRp that could be applied to rational antiviral drug design.

项目摘要/摘要（描述）：   RNA病毒可能是毁灭人类病原体，赋予社会巨大的医疗和经济负担 （例如，SARS-COV-2，Attractza A病毒，埃博拉病毒，轮状病毒等）。虽然这些病毒可能会有所不同 它们在发病机理中急剧具有共同的复制特征 - 它们必须合成新的RNA 来自RNA模板的分子。因为宿主细胞酶缺乏这种活性，所以RNA病毒编码了专业 RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）。病毒RDRP在结构上是在功能上保存的 潜水RNA病毒家族，它们直接催化病毒转录和基因组复制的所有阶段。 但是，这些酶在感染细胞的背景下很少单独发挥作用。相反，病毒rdrps紧密 在多亚基转录酶/复制酶复合酶中受其他蛋白质调节，以最大程度地和 病毒RNA合成的时间。该应用的总体目的是获得对RDRP的机械洞察力 轮状病毒的调节 - 一种11段的双链（DS）RNA病毒，导致威胁生命的腹泻 在幼儿。轮状病毒VP1 RDRP仅在绑定在Icosahedral VP2核心外壳下方时起作用 完整或部分完整的颗粒层。 VP2在早期粒子组装期间通过VP2的参与激活 RDRP使其充当复制酶，转换包装的，单链的正感觉（+）RNA 模板进入DSRNA基因组段。早期组装中间体，然后变成双层 粒子，其中VP2结合的VP1 RDRP开关转录到转录酶活性，使用合成 +RNA使用 DSRNA模板。尽管如此，知识的主要差距仍然关于VP1 RDRP的结构作为复制酶 在DSRNA合成期间，VP2核心壳蛋白调节。在这里，体外建立了 生化技术和遗传技术与最先进的结构方法结合在一起，以缩小这些差距 在知识和信息中，对轮状病毒RDRP调节有深刻的了解。 AIM 1将阐明VP2核心外壳 确定对VP1复制酶活性至关重要，AIM 2将确定有史以来第一个原位3D原子结构 VP1作为复制酶（使用冷冻EM）和液体（使用微流体系统）的复制酶。概述的工作 该应用很重要，因为预计将识别有关轮状病毒的详细结构功能信息 RDRP可以应用于理性抗病毒药物设计。