GENETICS AND FUNCTIONS OF KSHV GLYCOPROTEINS GM AND GN
KSHV 糖蛋白 GM 和 GN 的遗传学和功能
基本信息
- 批准号:7609939
- 负责人:
- 金额:$ 11.83万
- 依托单位:
- 依托单位国家:美国
- 项目类别:
- 财政年份:2007
- 资助国家:美国
- 起止时间:2007-05-01 至 2008-04-30
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:Biological AssayCellsCodon NucleotidesComputer Retrieval of Information on Scientific Projects DatabaseExtracellular SpaceFacility Construction Funding CategoryFundingGenesGeneticGenetic TranscriptionGenomeGlycoproteinsGrantHuman Herpesvirus 8InstitutionLyticMessenger RNAMutagenesisNucleotidesPolymerase Chain ReactionProductionResearchResearch PersonnelResourcesSourceStructureTestingTimeTransfectionTransformed Cell LineUnited States National Institutes of HealthVero CellsViral GenomeViral ProteinsVirionVirusWorklytic replicationnovelresearch study
项目摘要
This subproject is one of many research subprojects utilizing the
resources provided by a Center grant funded by NIH/NCRR. The subproject and
investigator (PI) may have received primary funding from another NIH source,
and thus could be represented in other CRISP entries. The institution listed is
for the Center, which is not necessarily the institution for the investigator.
A KSHV gM-null virus was constructed using transposon-insertion mutagenesis. The KSV gMnull genome was transfected into Vero cells and a permanently transformed cell line that harbors the viral genome was isolated and characterized. Real-time PCR TaqMan assays were developed against the lytic KSHV gene ORF59 and employed to assess the levels of infectious virus production intracellularly, as well as in extracellular spaces after induction of lytic replication. In addition, supernatant viruses were collected and tested in specialized infectivity assays. These experiments revealed that the gM-null virus egressed from cells and retained infectivity showing that KSHV gM is not essential for virion egress and infectivity. A strategy was devised to silence the gB gene through the use of two siRNAs. Transient transfection of gene cassettes expressing anti-gB siRNAs efficiently silenced transcription of the gB gene in cotransfection experiments in 293 cells, as well as in BCBL-1 cells. Real time PCR (TaqMan) and infectivity assays showed that gB is essential for virion egress and infectivity. A novel aspect of this work is the construction of a partially codon-optimized gB gene in which the first 500 nucleotides of the gB gene have been altered to not be recognized by the anti-gB siRNAs. Transfection of a gene construct expressing the codon optimized gB gene efficiently rescued virion egress and infectivity in BCBL-1 cells. These results constitute proof-of-principle that the structure and function of gB and other viral proteins can be effectively studied using conditional inhibition of KSHV mRNA transcription by siRNAs.
该子项目是利用该技术的众多研究子项目之一
资源由 NIH/NCRR 资助的中心拨款提供。子项目及
研究者 (PI) 可能已从 NIH 的另一个来源获得主要资金,
因此可以在其他 CRISP 条目中表示。列出的机构是
对于中心来说,它不一定是研究者的机构。
使用转座子插入诱变构建 KSHV gM 无效病毒。 KSV gMnull 基因组被转染到 Vero 细胞中,并分离并鉴定了含有病毒基因组的永久转化细胞系。针对裂解性 KSHV 基因 ORF59 开发了实时 PCR TaqMan 检测,用于评估细胞内以及诱导裂解性复制后细胞外空间中感染性病毒的产生水平。此外,收集上清病毒并在专门的感染性测定中进行测试。这些实验表明,gM 无效的病毒从细胞中排出并保留了感染性,这表明 KSHV gM 对于病毒颗粒的排出和感染性并不是必需的。设计了一种策略,通过使用两种 siRNA 来沉默 gB 基因。在 293 细胞以及 BCBL-1 细胞的共转染实验中,瞬时转染表达抗 gB siRNA 的基因盒可有效沉默 gB 基因的转录。实时 PCR (TaqMan) 和感染性测定表明 gB 对于病毒颗粒的排出和感染性至关重要。这项工作的一个新颖方面是构建部分密码子优化的gB基因,其中gB基因的前500个核苷酸已被改变以不被抗gB siRNA识别。表达密码子优化的 gB 基因的基因构建体的转染有效地挽救了 BCBL-1 细胞中的病毒粒子流出和感染性。这些结果证明了可以利用 siRNA 有条件抑制 KSHV mRNA 转录来有效研究 gB 和其他病毒蛋白的结构和功能。
项目成果
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专著数量(0)
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