Characterization of assembly and activation of the Shigella type III secretion injectisome
III 型志贺氏菌分泌注射剂的组装和激活的表征
基本信息
- 批准号:10535257
- 负责人:
- 金额:$ 63.09万
- 依托单位:
- 依托单位国家:美国
- 项目类别:
- 财政年份:2022
- 资助国家:美国
- 起止时间:2022-08-01 至 2027-07-31
- 项目状态:未结题
- 来源:
- 关键词:Adaptor Signaling ProteinAgeAmino AcidsArchitectureBiochemicalCell membraneCellsChildChildhoodCognitiveCommunicationComplementComplexCryo-electron tomographyDataDevelopmentDiarrheaDissectionDysenteryElementsEnsureEventFoundationsFutureImageImpairmentIn SituIn VitroIncidenceInvestigationKnowledgeLarge IntestineLearningMembraneMethodsModelingMolecularMolecular AnalysisMorbidity - disease rateMovementMutation AnalysisNatureNeedlesPositioning AttributeProcessProteinsPublic HealthResearchResolutionShigellaShigella InfectionsSorting - Cell MovementStructureStructure-Activity RelationshipSystemTertiary Protein StructureTestingType III Secretion System PathwayVirulenceVirulence FactorsVisualizationbiophysical analysisbiophysical techniquesdensityflexibilityimaging approachimaging modalityimprovedinsightkinetosomemortalitymutantnanomachinenew therapeutic targetpathogenprotein protein interactionsmall molecule inhibitor
项目摘要
PROJECT SUMMARY
Shigella causes bacillary dysentery with high worldwide morbidity and childhood mortality with complications
that include cognitive and developmental impairment in children suffering multiple diarrheal episodes each year.
Shigella’s main virulence factor is its type III secretion system (T3SS), which is used to deliver effector proteins
into host cells to promote pathogen entry. T3SSs are shared by many Gram negative pathogens with the
injectisome comprising a(n): 1) external needle and tip complex for delivering translocators and effectors; 2)
basal body that spans the bacterial envelope; and 3) cytoplasmic sorting platform (SP) that energizes and
controls secretion. We pioneered visualizing the SP by cryo-electron tomography (cryo-ET) and since then we
and others have identified the components of the SP. We now propose studies to explore structural differences
between the “on” and “off” secretion states for the in situ injectisome with parallel biochemical analysis of the SP
sub-assemblies and the first visualization of the Shigella injectisome-host membrane interface in situ. We will
use cryo-ET methods to view the SP pods at a 1-nm or better resolution and then use biochemical and molecular
methods as we develop models of assembly and function. In our investigation of the SP, we will explore the
movement of protein domains at the SP interface with the inner membrane ring. In parallel, we will extend our
study to examine another important cytoplasmic component of the injectisome - the export gate nonamer formed
by MxiA, which undergoes structural rearrangements in the absence of the SP. We will also exploit a system
we’ve generated for trapping different secretion substrates within the in situ injectisome so that we can determine
how the overall structure compares for three different states. These are the “on” injectisome (ipaD null strain)
and two forms of “off” injectisomes (mxiH null strain and effector-blocked strains), which will provide functional
insight into SP and export gate communication and association. We propose three complementary aims: 1)
Define the makeup, intermediate states and structural requirements at the SP/inner-membrane ring (IR) interface
that allow SP assembly and guide type III secretion. 2) Correlate export gate structural features with secretion
status using complementary cryo-ET and molecular methods; and 3) Identify the structural changes associated
with trapping substrates within the in situ injectisome and begin generating the first high-resolution picture of the
injectisome-host membrane interface in situ using cryo-ET. Improved cryo-ET methods provide an
unprecedented view of substructures within the Shigella injectisome in situ to reveal elements that cannot be
studied using purified needle complexes and this is reflected in the preliminary data presented here. We can
now visualize these sub-structures, target them for molecular analysis and purify them for in vitro biochemical
and biophysical analysis. The T3SS is an essential virulence determinant for many pathogens, but we still lack
the structural understanding needed to determine the mechanisms that underlie type III secretion.
项目概要
志贺氏菌引起细菌性痢疾,全球发病率和儿童死亡率很高,并伴有并发症
其中包括每年多次腹泻的儿童的认知和发育障碍。
志贺氏菌的主要毒力因子是其 III 型分泌系统 (T3SS),用于传递效应蛋白
许多革兰氏阴性病原体与宿主细胞共享 T3SS。
注射体,包含:1)用于递送易位器和效应器的外部针和尖端复合物;
跨越细菌包膜的基体;3) 细胞质分选平台 (SP),其提供能量和
我们率先通过冷冻电子断层扫描(cryo-ET)对 SP 进行可视化,从那时起我们就开始研究。
和其他人已经确定了 SP 的组成部分,我们现在提出研究来探索结构差异。
通过 SP 的平行生化分析,确定原位注射体的“开”和“关”分泌状态
我们将实现子组件和志贺氏菌注射体-宿主膜界面的首次可视化。
使用冷冻 ET 方法以 1 nm 或更高的分辨率查看 SP pod,然后使用生化和分子
我们开发装配和功能模型时的方法 在我们对 SP 的研究中,我们将探索
同时,我们将扩展 SP 与内膜环界面处的蛋白质结构域的运动。
研究检查注射体的另一个重要细胞质成分 - 形成的出口门 noamer
由 MxiA 在没有 SP 的情况下进行结构重组 我们还将利用一个系统。
我们已经生成了用于在原位注射体内捕获不同分泌底物的方法,以便我们可以确定
三种不同状态的整体结构如何比较 这些是“on”注射体(ipaD 无效菌株)。
以及两种形式的“关闭”注射体(mxiH 无效菌株和效应子阻断菌株),这将提供功能性
深入了解 SP 和出口门的沟通和关联,我们提出三个互补目标:1)
定义 SP/内膜环 (IR) 界面的构成、中间状态和结构要求
允许 SP 组装并引导 III 型分泌 2) 将输出门结构特征与分泌相关联。
使用互补的冷冻电子断层扫描和分子方法确定状态;以及 3) 识别相关的结构变化
将底物捕获在原位注射体内,并开始生成第一张高分辨率图像
使用冷冻电子断层扫描(cryo-ET)原位注射体-宿主膜界面提供了一种方法。
对志贺氏菌注射体内的子结构进行前所未有的观察,以揭示无法被识别的元素
使用纯化的针复合物进行了研究,这反映在此处提供的初步数据中。
现在可视化这些子结构,针对它们进行分子分析并纯化它们以进行体外生物化学
T3SS 是许多病原体的重要毒力决定因素,但我们仍然缺乏。
确定 III 型分泌机制所需的结构理解。
项目成果
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专著数量(0)
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