ENaC Regulation by Cell Surface Associated SGK1

细胞表面相关 SGK1 对 ENaC 的调节

基本信息

批准号：
8734591
负责人：
ALAN C PAO
金额：
$ 14.1万
依托单位：
PALO ALTO VETERANS INSTIT FOR RESEARCH
依托单位国家：
美国
项目类别：
财政年份：
2013
资助国家：
美国
起止时间：
2013-09-19 至 2015-08-30
项目状态：
已结题

项目摘要

DESCRIPTION (provided by applicant): Epithelial sodium channel (ENaC) activity in the collecting duct is essential for maintaining extracellular fluid volume and blood pressure. Serum and glucocorticoid regulated kinase 1 (sgk1) has emerged as a key component of the aldosterone signaling pathway that stimulates ENaC in the collecting duct. The most studied mechanism by which sgk1 increases ENaC activity involves an increase in the number of channels in the apical cell membrane. However, our laboratory has recently demonstrated that sgk1 can also stimulate the open probability (Po) of ENaC, which represents a novel means by which sgk1 acts. There remain critical gaps in our knowledge about the mechanisms that underlie sgk1 regulation of ENaC, including questions about: 1) how does sgk1 stimulate ENaC Po, and 2) whether this mode of ENaC regulation is physiologically important. The objective of the proposed research is to define novel mechanisms by which sgk1 stimulates ENaC Po in the collecting duct and determine whether this mode of ENaC regulation is important in vivo. We hypothesize that sgk1 interacts with and phosphorylates ENaC to stimulate channel Po. This mechanism of sgk1 action is distinct from sgk1-mediated regulation of Nedd4-2, a major regulator of cell surface ENaC expression. We propose three Specific Aims. In Aim 1, we will test whether sgk1 stimulates ENaC Po independent of Nedd4-2. We will introduce mutations in sgk1 or ENaC that: 1) disrupt Nedd4-2-mediated regulation of ENaC; or 2) disrupt ENaC gating. We will then test whether sgk1 can still increase channel Po under these conditions. We will also test whether sgk1 can stimulate ENaC Po in split-open collecting ducts from Nedd4-2 knockout mice. In Aim 2, we will test whether sgk1 stimulates ENaC Po through channel phosphorylation. We will use site- directed mutagenesis to identify sites in ENaC that are phosphorylated by sgk1. We will then test whether sgk1 can stimulate Po of these mutant channels. In Aim 3, we will test whether sgk1 stimulates ENaC Po through channel interaction. We will use site-directed mutagenesis and blocking peptides to identify sites in sgk1 responsible for mediating interaction with ENaC. We will use these sgk1 mutants and cell-permeant peptides to disrupt the sgk1-ENaC interaction and test whether these reagents will impair sgk1-mediated stimulation of ENaC Po and activity in collecting duct cells and split-open collecting ducts from wild type mice. The proposed research is expected to expand the current paradigm of sgk1 action and provide novel insights into how sgk1 stimulates ENaC Po in the collecting duct. We expect that this research will delineate the mechanisms by which sgk1 stimulates ENaC Po and establish the physiological importance of this mode of ENaC regulation in vivo. The impact of the proposed research may provide new insights into the pathogenesis of hypertension and suggest new targets (e.g. sgk1-ENaC interaction) for therapeutic intervention.

描述（由申请人提供）：集合管中的上皮钠通道（ENaC）活性对于维持细胞外液容量和血压至关重要。血清和糖皮质激素调节激酶 1 (sgk1) 已成为刺激集合管中 ENaC 的醛固酮信号通路的关键组成部分。 sgk1 增加 ENaC 活性的研究最多的机制涉及顶端细胞膜通道数量的增加。然而，我们的实验室最近证明，sgk1 还可以刺激 ENaC 的开放概率（Po），这代表了 sgk1 发挥作用的一种新颖手段。我们对 sgk1 调节 ENaC 的机制的了解仍然存在重大差距，包括以下问题：1）sgk1 如何刺激 ENaC Po，以及 2）这种 ENaC 调节模式是否具有生理重要性。本研究的目的是确定 sgk1 刺激集合管中 ENaC Po 的新机制，并确定这种 ENaC 调节模式在体内是否重要。我们假设 sgk1 与 ENaC 相互作用并磷酸化 ENaC 以刺激 Po 通道。 sgk1 的这种作用机制不同于 sgk1 介导的 Nedd4-2 调节，Nedd4-2 是细胞表面 ENaC 表达的主要调节因子。我们提出三个具体目标。在目标 1 中，我们将测试 sgk1 是否独立于 Nedd4-2 刺激 ENaC Po。我们将在 sgk1 或 ENaC 中引入突变，这些突变：1) 破坏 Nedd4-2 介导的 ENaC 调节；或 2) 破坏 ENaC 门控。然后我们将测试在这些条件下sgk1是否仍然可以增加通道Po。我们还将测试 sgk1 是否可以刺激 Nedd4-2 敲除小鼠分裂开放的集合管中的 ENaC Po。在目标 2 中，我们将测试 sgk1 是否通过通道磷酸化刺激 ENaC Po。我们将使用定点诱变来识别 ENaC 中被 sgk1 磷酸化的位点。然后我们将测试sgk1是否可以刺激这些突变通道的Po。在目标 3 中，我们将测试 sgk1 是否通过通道相互作用刺激 ENaC Po。我们将使用定点诱变和封闭肽来识别 sgk1 中负责介导与 ENaC 相互作用的位点。我们将使用这些 sgk1 突变体和细胞渗透肽来破坏 sgk1-ENaC 相互作用，并测试这些试剂是否会损害 sgk1 介导的 ENaC Po 刺激以及集合管细胞和野生型小鼠分裂打开的集合管的活性。拟议的研究预计将扩展当前 sgk1 作用的范式，并为 sgk1 如何刺激集合管中的 ENaC Po 提供新的见解。我们期望这项研究将描述 sgk1 刺激 ENaC Po 的机制，并确定这种 ENaC 体内调节模式的生理重要性。拟议研究的影响可能会为高血压的发病机制提供新的见解，并为治疗干预提出新的靶点（例如 sgk1-ENaC 相互作用）。