RNA BIOSYNTHESIS IN ESCHERICHIA COLI
大肠杆菌中的 RNA 生物合成
基本信息
- 批准号:2186806
- 负责人:
- 金额:$ 25.08万
- 依托单位:
- 依托单位国家:美国
- 项目类别:
- 财政年份:1993
- 资助国家:美国
- 起止时间:1993-06-01 至 1997-05-31
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:DNA directed RNA polymerase Escherichia coli RNA affinity labeling autoradiography bacterial genetics crosslink enzyme activity gene expression genetic promoter element high performance liquid chromatography immobilized enzymes nucleic acid biosynthesis nucleic acid hybridization nucleic acid probes protein structure function radiotracer transcription factor
项目摘要
A study of structure-function relationships in DNA-dependent RNA
polymerase (RNAP) of Escherichia coli is proposed which will use a
combination of protein-chemical and enzymological approaches. The
ultimate goal of this study is the understanding of RNAP basic function
and regulation in molecular detail, and the uncovering of the underlying
structural determinants.
The emphasis of this project is on topology of the ternary transcription
complex as it propagates along DNA. We will test the model that the
movement of the complex occurs in the "inchworm" fashion whereby the
enzyme compresses and extends with the amplitude of several nucleotides.
Understanding of the mechanism of RNA polymerase propagation will provide
clues to the design of this enzyme as a multifunctional molecular machine
which serves as the target to factors that regulate gene expression.
The proposed study will be focused on the RNA component of the ternary
complex. Three principal approaches will be used. First we intend to
use crosslinkable affinity probes incorporated into defined positions in
the transcript to fix RNA in the complex, and then to study such complex
enzymatically. The impediment to the normal RNA chain extension
resulting from the crosslink will help understand the mechanism of RNAP
propagation.
The second approach employs the GreA protein, a novel transcript cleavage
factor that we discovered, as a probe of RNA topology in the ternary
complex. GreA cleaves the nascent transcript exposed in the vicinity of
the enzyme's catalytic center. From the changes of the cleavage pattern
that take place during complex propagation we expect to learn about the
mechanism of the enzyme movement.
Finally, we propose to identify amino acids involved in contacts with RNA
in the ternary complex, and the length of DNA-RNA hybrid region by means
of affinity labeling with probes incorporated into the transcript
followed by mapping the adducts using methods of protein and nucleic acid
chemistry.
DNA依赖性RNA中结构功能关系的研究
提出了大肠杆菌的聚合酶(RNAP),该聚合酶将使用
蛋白质化学和酶学方法的结合。 这
这项研究的最终目标是理解RNAP基本功能
和分子细节的调节,并揭开基础
结构决定因素。
该项目的重点是三元转录的拓扑
复合物沿着DNA传播。 我们将测试模型
该建筑群的运动发生在“英寸虫”的时尚中
酶压缩并随几个核苷酸的振幅延伸。
了解RNA聚合酶传播机制将提供
该酶作为多功能分子机的设计线索
它是调节基因表达的因素的目标。
拟议的研究将集中于三元的RNA成分
复杂的。 将使用三种主要方法。 首先我们打算
使用包含在定义位置的交联亲和力探针
固定复合物中RNA的转录本,然后研究这种复合物
酶上。 正常RNA链扩展的障碍
由交叉链接产生的将有助于了解RNAP的机制
传播。
第二种方法采用GREA蛋白,这是一种新型的成绩单裂解
我们发现的因素,作为三元中RNA拓扑的探测
复杂的。 Grea裂解在附近暴露的新生转录本
酶的催化中心。 从切割模式的变化
这是在复杂传播期间发生的
酶运动的机理。
最后,我们建议鉴定与RNA接触涉及的氨基酸
在三元复合物和DNA-RNA杂交区域的长度中
与成绩单中合并的探针的亲和力标记
然后使用蛋白质和核酸方法映射加合物
化学。
项目成果
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