DNA-PROTEIN INTERACTIONS IN AIDS VIRUS DNA

艾滋病病毒 DNA 中的 DNA-蛋白质相互作用

• 批准号: 2181313
• 负责人: JACK D GRIFFITH
• 金额: $ 21.16万
• 依托单位: UNIV OF NORTH CAROLINA CHAPEL HILL
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 1989
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 1989-04-01 至 1996-08-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/2181313
• 关键词: DNA binding protein; DNA topoisomerases; chromatin; electron microscopy; gel electrophoresis; genetic mapping; human immunodeficiency virus; nucleic acid repetitive sequence; nucleic acid structure; nucleosomes; tissue /cell culture; transfection; virus DNA

Studies central to the life cycle of HIV virus --the structure of HIV DNA as chromatin will continue. Our working hypothesis is that to understand the control of HIV gene expression and where on the HIV genome there may be open windows for anti-viral agents, one must understand how HIV DNA is arranged by the histones, topoisomerases, and other proteins into chromatin in the infected cell. This data is critical for defining optimal drug target sites since the assembly of a potential target site into a nucleosome would mask it from attack. Thus a major goal is to locate gaps in the HIV chromatin sheath. Using high resolution electron microscopy (EM) and molecular tools, and building on our in vitro maps of nucleosome assembly and DNA bending for HIV, we will map sites of nucleosome assembly and exclusion on HIV DNA in vivo. This will utilize the ACH-2 CD4+ T cell line harboring a single integrated HIV genome, and an HIV-ebv minichromosome that we will construct from plasmids containing the EBV plasmid origin plus EBNA-1 coding sequences into which the HIV genome will be inserted for growth in human T cells. Using DnaseI and chemical probes, sites of nuclease hypersensitivity (nucleosome-free sites) will be mapped both on the integrated HIV genome in ACH-2 cells and on the unintegrated episomal HIV genomes of the HIV-ebv minichromosomes. This mapping will use amplified radiolabeled primer extension and gel electrophoresis. Topoisomerase II (topoII) cleavage and binding sites will be mapped on HIV DNA, in vitro, using EM and gel electrophoresis. Using the methods employed for mapping nucleosome positioning, topoII cleavage sites will be mapped on HIV chromatin in vivo using the ACH-2 cells and the HIV-ebv minichromosomes. EM studies will examine the folding of the HIV 5' LTR in isolated HIV-ebv minichromosomes and reconstituted with cellular LTR binding proteins. Future extension of these approaches could provide a means of inactivating oncogenes in neoplastic cells.

HIV病毒生命周期的核心研究——HIV DNA结构 因为染色质将继续。 我们的工作假设是要理解 HIV 基因表达的控制以及 HIV 基因组上可能存在的位置 为抗病毒药物打开窗口，必须了解 HIV DNA 是如何存在的 由组蛋白、拓扑异构酶和其他蛋白质排列成 受感染细胞中的染色质。 该数据对于定义至关重要 自组装潜在靶位点以来的最佳药物靶位点 进入核小体会掩盖它免受攻击。 因此，一个主要目标是 定位 HIV 染色质鞘中的间隙。使用高分辨率电子 显微镜 (EM) 和分子工具，并以我们的体外图谱为基础 HIV 的核小体组装和 DNA 弯曲，我们将绘制以下位点图 体内 HIV DNA 的核小体组装和排除。 这将利用 ACH-2 CD4+ T 细胞系含有单一整合的 HIV 基因组，以及 我们将从包含以下内容的质粒构建 HIV-ebv 微型染色体 EBV 质粒起点加上 EBNA-1 编码序列，HIV 病毒进入其中 基因组将被插入人类 T 细胞中生长。 使用 DNAseI 和 化学探针、核酸酶超敏位点（无核小体 位点）将被映射到 ACH-2 细胞中的整合 HIV 基因组上 以及 HIV-ebv 未整合的附加型 HIV 基因组 微型染色体。 该映射将使用扩增的放射性标记引物 延伸和凝胶电泳。 拓扑异构酶 II (topoII) 裂解 结合位点将在体外使用 EM 和凝胶绘制在 HIV DNA 上 电泳。 使用用于绘制核小体的方法 定位后，topoII 切割位点将被定位在 HIV 染色质上 使用 ACH-2 细胞和 HIV-ebv 微型染色体进行体内实验。 电磁学研究 将检查分离的 HIV-ebv 中 HIV 5' LTR 的折叠 微型染色体并用细胞 LTR 结合蛋白重建。 这些方法的未来扩展可以提供一种手段 使肿瘤细胞中的癌基因失活。