Regulation of V-ATPases by Phosphoinositides

磷酸肌醇对 V-ATP 酶的调节

基本信息

  • 批准号:
    10162616
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 27.54万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2018
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2018-08-01 至 2023-05-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

PROJECT SUMMARY V-ATPases are highly conserved, multisubunit proton pumps that acidify organelles including lysosomes, endosomes, Golgi apparatus, and secretory granules in all eukaryotic cells. Each of these organelles requires tuning of its luminal pH to a narrow range for its function. However, it is not fully understood how these pH ranges are maintained or how V-ATPases in different organelles respond when environmental conditions challenge local pH gradients. Our central hypothesis is that PI lipids provide organelle-specific inputs to locally regulate V-ATPase activity, and thus can impact individual subsets of the many functions dependent on V-ATPase activity and organelle acidification. In Aim 1, we use the well- characterized yeast V-ATPase system to characterize binding of the cytosolic domains of the membrane- bound a-subunit isoforms, Vph1 and Stv1, to phosphoinositide (PI) lipids. We have found that vacuole-resident Vph1 is able to bind the vacuolar signaling lipid PI(3,5)P2 and Golgi-resident Stv1 prefers the Golgi-enriched lipid PI(4)P. We will quantify and characterize these binding preferences and probe how binding of specific lipids activates V-ATPases containing individual a-subunit isoforms. Based on recent structures and homology modeling, we will then develop lipid-binding mutants for each isoform. Finally, we will evaluate PI binding specificities of the four human a-subunit isoforms. We have tested three of the four human isoforms and found evidence of PI-specific interactions in vitro. We will characterize specificity and affinities of PI binding and identify potential binding sites. In Aim 2, we address the spatial and temporal consequences of PI lipid binding to intact V-ATPases containing full-length Vph1 and Stv1. We hypothesize that PI lipids exert spatial control by activating V-ATPases in their organelles of residence. Specifically, we propose that: 1) PI(3,5)P2 binding to Vph1-containing V-ATPases induces a conformation that stabilizes interactions between the peripheral V1 sector and the integral membrane Vo sector of the V-ATPase, increasing activity, 2) PI(4)P binding to Stv1- containing V-ATPases promotes retention in the Golgi apparatus, and 3) PI(3)P promotes acidification of the endocytic pathway by interacting with Vph1-containing V-ATPases. In contrast, hyperosmotic stress promotes a rapid and transient rise in PI(3,5)P2 that reversibly activates Vph1-containing V-ATPases in the vacuole. We will analyze the mechanisms of this temporal V-ATPase activation and its role in providing short-term adaptation to salt stress. These experiments link PI and V-ATPase isoform content, two fundamental features of organelle identity. They promise to provide novel insights into the many diseases linked to defective organelle acidification, including neurodegeneration, cancer, and mycobacterial infection, and could suggest new therapeutic routes.
项目概要 V-ATP 酶是高度保守的多亚基质子泵,可酸化细胞器,包括 所有真核细胞中的溶酶体、内体、高尔基体和分泌颗粒。这些中的每一个 细胞器需要将其管腔 pH 值调整到一个狭窄的范围才能发挥其功能。然而,它并不完全 了解如何维持这些 pH 范围或不同细胞器中的 V-ATP 酶如何响应 环境条件对局部 pH 梯度提出了挑战。我们的中心假设是 PI 脂质提供 细胞器特异性输入来局部调节 V-ATP 酶活性,因此可以影响单个子集 许多功能依赖于 V-ATP 酶活性和细胞器酸化。在目标 1 中,我们使用井 表征酵母 V-ATPase 系统来表征膜胞质结构域的结合 将 a 亚基亚型 Vph1 和 Stv1 与磷酸肌醇 (PI) 脂质结合。我们发现液泡驻留 Vph1 能够结合液泡信号脂质 PI(3,5)P2,并且高尔基体驻留的 Stv1 更喜欢富含高尔基体的 脂质 PI(4)P。我们将量化和表征这些结合偏好,并探讨特定的结合方式 脂质激活含有单个 a 亚基亚型的 V-ATP 酶。基于最近的结构和同源性 建模后,我们将为每种亚型开发脂质结合突变体。最后,我们将评估 PI 绑定 四种人类 a 亚基亚型的特异性。我们测试了四种人类亚型中的三种并发现 体外 PI 特异性相互作用的证据。我们将表征 PI 结合的特异性和亲和力 识别潜在的结合位点。在目标 2 中,我们解决 PI 脂质结合的空间和时间后果 到包含全长 Vph1 和 Stv1 的完整 V-ATP 酶。我们假设 PI 脂质通过以下方式发挥空间控制作用: 激活其驻留细胞器中的 V-ATP 酶。具体来说,我们建议: 1) PI(3,5)P2 结合 含有 Vph1 的 V-ATP 酶可诱导稳定外周 V1 之间相互作用的构象 V-ATPase 的扇区和整合膜 Vo 扇区,增加活性,2) PI(4)P 与 Stv1- 结合 含有 V-ATP 酶可促进高尔基体中的滞留,并且 3) PI(3)P 可促进高尔基体的酸化 通过与含有 Vph1 的 V-ATP 酶相互作用而形成内吞途径。相反,高渗应激会促进 PI(3,5)P2 快速而短暂地升高,可逆地激活液泡中含有 Vph1 的 V-ATP 酶。我们 将分析这种暂时性 V-ATP 酶激活的机制及其在提供短期 适应盐胁迫。这些实验将 PI 和 V-ATPase 同工型含量(两个基本特征)联系起来 细胞器身份。他们承诺为与缺陷相关的许多疾病提供新的见解 细胞器酸化,包括神经变性、癌症和分枝杆菌感染,并可能表明 新的治疗途径。

项目成果

期刊论文数量(4)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Regulation of V-ATPase Activity and Organelle pH by Phosphatidylinositol Phosphate Lipids.
磷脂酰肌醇磷酸脂调节 V-ATP 酶活性和细胞器 pH 值。
  • DOI:
  • 发表时间:
    2020
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    Banerjee, Subhrajit;Kane, Patricia M
  • 通讯作者:
    Kane, Patricia M
Human V-ATPase a-subunit isoforms bind specifically to distinct phosphoinositide phospholipids.
人 V-ATP 酶 a 亚基异构体与不同的磷酸肌醇磷脂特异性结合。
  • DOI:
  • 发表时间:
    2023-04-24
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    Mitra, Connie;Kane, Patricia M
  • 通讯作者:
    Kane, Patricia M
Chimeric a-subunit isoforms generate functional yeast V-ATPases with altered regulatory properties in vitro and in vivo.
嵌合 a 亚基异构体产生功能性酵母 V-ATP 酶,其在体外和体内的调节特性发生改变。
  • DOI:
  • 发表时间:
    2023-03-01
  • 期刊:
  • 影响因子:
    3.3
  • 作者:
    Tuli, Farzana;Kane, Patricia M
  • 通讯作者:
    Kane, Patricia M
Human V-ATPase a-subunit isoforms bind specifically to distinct phosphoinositide phospholipids.
人 V-ATP 酶 a 亚基异构体与不同的磷酸肌醇磷脂特异性结合。
  • DOI:
  • 发表时间:
    2023-12
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    Mitra, Connie;Winkley, Samuel;Kane, Patricia M
  • 通讯作者:
    Kane, Patricia M
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