非特異的結合のない超高感度ウィルス検出に向けたデジタル免疫測定法

用于超灵敏病毒检测的数字免疫分析，无需非特异性结合

基本信息

批准号：
13F03378
负责人：
野地博行
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、独自に開発した１分子デジタル酵素結合免疫吸着（デジタルELISA）法を改良して、標識抗体の非特異的結合の影響を受けない超高感度デジタルELISA法の確立を目指している。デジタルELISA法では、確率的に１分子の捕捉抗体―抗原－酵素標識抗体のELISA複合体をマイクロビーズ上に固定化し、これを１個ずつ体積フェムトリットルサイズの超微小溶液チャンバーに封入する。ビーズがELISA複合体を結合する場合、酵素が産生する蛍光性反応生成物がチャンバー中に蓄積するため、光るチャンバー数を数え上げるだけで抗原分子数を1分子単位で検出することができる。これまで、通常法と比較して100万倍という超高感度化に成功しており、ウィルス等の感染因子の超高感度検出への応用が強く期待されている。しかし、現在用いられている標識用の酵素であるβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)は、反応速度が毎秒10回程度と遅く、定量的な蛍光強度計測が極めて難しい。そこで、本プロジェクトでは、まずβ-galを、蛍光アッセイ用の人工基質(FDG)に最適化するための進化分子工学実験に取り組んでいる。これまでに、野生型β-gal遺伝子をクローニングし、その配列確認を行った。その後、β-galの精製法を確立した後酵素速度論的な評価を行った結果、文献値とほぼ一致することを確認した。また、精製β-galの安定な保存条件も探索し、再現性の良い酵素評価系の確立に成功した。更に、酵素のスクリーニング実験に向けて、マイクロチャンバーアレイデバイスで１分子からの無細胞タンパク質合成を実現した。スクリーニングの際、遺伝子型と表現型を対応づけるため、１分子DNAを回収・増幅する技術を確立した。それにより、優れたタンパク質変異体を遺伝子レベルで簡単に調べられるようにした。

在本研究中，我们旨在改进独特开发的单分子数字酶联免疫吸附（数字ELISA）方法，建立不受标记抗体非特异性结合影响的超灵敏数字ELISA方法。在数字ELISA方法中，将一分子捕获抗体-抗原-酶标抗体ELISA复合物随机固定在微珠上，并将每个珠子密封在飞升体积的超微溶液室中。当珠子与 ELISA 复合物结合时，酶产生的荧光反应产物会积聚在腔室中，从而只需计算发光腔室的数量即可检测单个分子单位中抗原分子的数量。到目前为止，我们已经成功实现了传统方法100万倍的超高灵敏度，人们对其应用于病毒等传染源的超灵敏检测抱有强烈的期望。然而，目前使用的标记酶β-半乳糖苷酶（β-gal）的反应速度较慢，约为每秒10次，因此定量测量荧光强度极其困难。因此，在这个项目中，我们首先进行进化分子工程实验，以优化β-gal作为荧光检测的人工底物（FDG）。目前，我们已经克隆了野生型β-gal基因并确认了其序列。随后，在建立了β-gal的纯化方法后，我们进行了酶动力学评价，证实结果与文献值几乎一致。我们还探索了纯化β-gal的稳定储存条件，并成功建立了具有良好重现性的酶评价体系。此外，对于酶筛选实验，我们使用微室阵列装置实现了单分子的无细胞蛋白质合成。在筛选过程中，我们建立了一种收集和扩增单分子 DNA 的技术，以便关联基因型和表型。这使得在基因水平上轻松研究优质蛋白质变体成为可能。