ナノ構造制約下におけるモータタンパク質による物質輸送系の設計原理構築

建立纳米结构约束下使用运动蛋白的质量运输系统的设计原则

基本信息

批准号：
13J01836
负责人：
藤本和也
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J01836/
关键词：
キネシン微小管マイクロ流体デバイスナノスリット能動輸送 1分子観察ナノトランスポートマイクロ流体システムモータタンパク質 PDMS マイクロチャネル物質輸送マイクロ流路トラッキング微小管アレイ

项目摘要

平成27年度においては，前年度までに確立した動的マイクロチャネル形成デバイスを利用し，高さ1マイクロメートル以下のチャネル内への微小管固定およびキネシン運動アッセイを確立した．マイクロチャネル内におけるキネシンの運動を観察した結果，このような微小な構造に制限された環境下でキネシンの運動は阻害されず，ナノスケールのアクチュエータとして利用できることを示した．また，キネシンによる輸送量を，チャネルの断面を単位時間あたりに横切るキネシン分子数を用いて評価した．同じチャネル内で，濃度勾配によって駆動される拡散輸送と比較したところ，キネシンによる能動輸送は1 マイクロメートル当たり2 nM程度の濃度差がある場合の拡散による輸送量と同程度であることがわかった．これらの結果は微小管およびキネシンを利用したマイクロ・ナノスケールにおける輸送系の構築に向けて，重要な知見であると考えられる．また，マイクロ・ナノファブリケーションをキネシン運動機構のより詳細な計測に応用することを目指した．具体的には，幅100ナノメートル程度のナノスリットを利用して，従来の手法では不可能な高濃度の蛍光ATP存在下におけるATP加水分解サイクルとキネシンステップ運動の同時計測を目的として実験系の構築を行った．まず，トラック中における励起光電場分布をシミュレーションし，適切なトラックの設計及び電子線描画を利用した製作プロセスを確立した．また，キネシン加水分解サイクルの基質活性を持つ蛍光ATPを選定し，キネシン運動と蛍光ATPの同時1分子観察が可能な分子系および光学系を確立した．これらの結果は，理学的に重要なキネシン運動機構の解明に向けて有用な手法となり得ると考えられるとともに，工学的な応用にむけても，キネシン機能の評価手法として有用なものとなることが期待できる．

2015财年，我们利用前一年建立的动态微通道形成装置，建立了高度小于1微米的通道中的微管固定化和驱动蛋白运动测定。通过观察微通道内驱动蛋白的运动，我们发现，在如此小的结构限制的环境中，驱动蛋白的运动不会受到抑制，并且可以用作纳米级致动器。另外，利用每单位时间穿过通道横截面的驱动蛋白分子的数量来评价驱动蛋白的输送量。与同一通道内浓度梯度驱动的扩散传输相比，当浓度差约为每微米 2 nM 时，驱动蛋白的主动传输与扩散传输的量相当。这些结果被认为是利用微管和驱动蛋白构建微米级和纳米级运输系统的重要发现。我们还旨在将微/纳米加工应用于驱动蛋白运动机制的更详细测量。具体来说，我们创建了一个实验系统，使用宽度约为100纳米的纳米缝，在高浓度荧光ATP存在下同时测量ATP水解循环和驱动蛋白步进运动，这是传统方法不可能构建的。首先，我们模拟了轨道中的激发光电场分布，并使用电子束光刻建立了适当的轨道设计和制造工艺。此外，我们选择了具有驱动蛋白水解循环底物活性的荧光ATP，并建立了一个分子和光学系统，可以同时单分子观察驱动蛋白运动和荧光ATP。这些结果被认为是阐明物理上重要的驱动蛋白运动机制的有用方法，并且也可以作为工程应用中评估驱动蛋白功能的方法。