細胞外環境での小さな操作分子イメージングツールの開発

细胞外环境中小型操纵分子成像工具的开发

基本信息

批准号：
13J11181
负责人：
鈴木貴久
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Fukushima Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-26 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

最終年度として、これまで作成したプローブ全体について、評価をとりまとめ、応用への可能性について検討した。本課題が最重要課題とした、細胞外環境イメージング、さらに分子間相互作用解析が、この課題内で作成した一連の蛍光プローブを用いてはじめて可能となったことが、細胞外マトリクスタンパクにおいて証明できた。分子間相互作用では光変換型蛍光タンパク改変体を用いて、その変換特性を利用したFLIM-FRETが有効である事を示した。さらにまた、小胞体内腔での分子ダイナミクスを厳密に測定する場合に、特にこの改良した光変換型蛍光プローブが有用性を持つことも示した。これらを用いる事により、小胞体構造の変化の見かけの分子拡散に与える影響について知る事ができた。蛍光タグの大きさの問題に着目したプロジェクトにおいては、phototropin由来フラビン結合タンパクから改変された分子においてもっともよくその有用性が示され、これまでライブイメージングで再現されてなかった分泌タンパクの変異の異常性が、この改変体において唯一、再現されることを示した。さらに、このタグの最大の課題であった輝度について、飽和変異を重ねることにより、最終的に、既報のプローブの2倍程度に改善することができた。これは分子イメージングとして実用に足りる明るさである。最終的に、本研究目的において開発した蛍光タグは10種類を超える。これらは、細胞がどのようにして酸化的環境における生存戦略を進めてきたかを理解する新たなツールとなると期待される。

在最后一年，我们总结了迄今为止创建的所有探针的评估并考虑了应用的可能性。我们能够证明，使用该项目中创建的一系列荧光探针，细胞外环境成像和分子相互作用分析（这是该项目最重要的问题）首次成为可能。对于分子间相互作用，我们使用修饰的光转换荧光蛋白，并证明利用其转换特性的 FLIM-FRET 是有效的。此外，我们表明这种改进的光转换荧光探针对于严格测量内质网腔中的分子动力学特别有用。通过使用这些，我们能够了解内质网结构的变化对表观分子扩散的影响。在一个专注于荧光标签大小问题的项目中，其有用性在由向光素衍生的黄素结合蛋白修饰的分子中得到了最好的证明，并且已被证明可用于检测以前未检测到的分泌蛋白中的异常突变。通过实时成像再现表明，该变体的性别得到了独特的再现。此外，通过重复饱和突变，我们能够将亮度（这是该标签面临的最大挑战）提高到之前报道的探针的大约两倍。这对于分子成像的实际应用来说足够明亮。最终，为了这项研究的目的，开发了 10 多种荧光标签。这些有望为理解细胞如何在氧化环境中制定生存策略提供新工具。