天然物生合成遺伝子の発現による大腸ガン原因物質の生合成および化学構造の決定

通过天然产物生物合成基因的表达进行结直肠癌致癌物质的生物合成和化学结构测定

基本信息

批准号：
13J10688
负责人：
石川格靖
金额：
$ 1.41万
依托单位：
University of Shizuoka
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

【背景・目的】コリバクチンは大腸菌IHE3034株が哺乳類細胞に感染した後、哺乳類細胞からの何らかのシグナル物質により誘導される化合物であると予測されている。従って、本化合物の単離は困難であり、未だ部分構造ですら明らかにされていない。一方、大腸がん発症患者の66.7 %から本菌が検出されている。そこで、本化合物の正体を有機化学的に明らかにし、大腸がん形成メカニズムの解明および予防のためのバイオマーカーとすることを目的として研究に着手した。【方法・結果】我々はコリバクチン生合成に必要とされるclbA~clbQの各遺伝子を発現し、in vitro反応による生合成経路の再構築を試みた。これまで、ペプチド合成酵素 (nonribosomal peptide synthase, NRPS) であるClbNより生合成が開始され、次にNRPSとポリケタイド合成酵素 (PKS) 複合体であるClbBへ受け渡されることが報告されていた。そこでClbN、ClbBの発現ベクターを作製し、これを用い大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体の代謝産物をLC－MSに供した結果、ミリスチン酸、D-AsnおよびL-Ala縮合体の生成が観測された。本化合物はClbNとClbBのNRPSにより生合成されるものと予測され、ClbB のPKSによる代謝産物を確認することはできなかった。これはClbBのC末端にチオエステラーゼは存在せず、生合成中間体が切り出されなかったためと考えられた。そこで化学合成した推定生合成中間体を標品とし、ClbNとClbBの生合成産物を解析した。その結果、ClbNはN-myristoyl-D-asparagine (1) を生産していることが明らかとなった。次に、本化合物をClbBと反応させたところ、ClbB代謝産物は1とL-Alaおよびマロン酸縮合体 (2) であることが特定された。続いて、2を基質に遺伝子クラスター内の各PKSと反応させたところ、新規代謝産物中間体を見いだすことに成功した。

[背景/目的] Colibactin 预计是大肠杆菌 IHE3034 感染哺乳动物细胞后，由某些信号物质诱导产生的化合物。因此，分离该化合物非常困难，甚至其部分结构也尚未阐明。另一方面，66.7%的结直肠癌患者中检测到了这种细菌。因此，我们开始研究，旨在有机地阐明该化合物的身份，并将其用作阐明结直肠癌形成机制和预防结直肠癌的生物标志物。 [方法/结果]我们表达了大肠杆菌素生物合成所需的clbA至clbQ基因，并尝试通过体外反应重建生物合成途径。此前有报道称，生物合成由非核糖体肽合酶（NRPS）ClbN启动，然后转移至NRPS和聚酮化合物合酶（PKS）的复合物ClbB。因此，创建了 ClbN 和 ClbB 的表达载体并用于转化大肠杆菌。当对获得的转化体的代谢物进行LC-MS时，观察到肉豆蔻酸、D-Asn和L-Ala缩合物的产生。该化合物预计由 ClbN 和 ClbB 的 NRPS 生物合成，并且无法确认 ClbB 的 PKS 代谢物。这被认为是因为ClbB的C末端不存在硫酯酶，并且生物合成中间体没有被切除。因此，我们使用化学合成的假定生物合成中间体作为标准分析了 ClbN 和 ClbB 的生物合成产物。结果表明，ClbN 产生 N-肉豆蔻酰-D-天冬酰胺 (1)。接下来，将该化合物与ClbB反应，鉴定出ClbB代谢物为1、L-Ala和丙二酸缩合物(2)。接下来，通过以2为底物使2与基因簇中的每个PKS发生反应，他们成功地发现了一种新的代谢中间体。