脂質二重膜中に埋め込まれた蛋白質1分子のエバネッセント場照明によるイメージング

使用倏逝场照明对嵌入脂质双层中的单个蛋白质分子进行成像

基本信息

批准号：
10135208
负责人：
齋藤究
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

近接場照明を使って、タンパク質1分子の酵素反応を可視化し、それに共役しておこる物理反応(回転、滑り運動)を同時にイメージングすることを目的にして研究を遂行した。近接場照明を生体試料の蛍光観察に応用するときには、試料のガラス表面への固定が問題となってくる。生きたままの試料を観察するために必要な条件として蛋白質分子への影響が少ないことがあげられる。また、強固に結合していることや、取り扱いやすいことなども重要な点である。本年度は、これらの条件を満たす方法としてHis-Tagを用いた蛋白質分子のガラス表面への固定方法を試みた。ガラス表面にNi-NTAを結合させるために、ガラス表面にSH基を導入したあと、アミノ基の結合したNTA(AB-NTA、同仁)を結合させた。ATP加水分解酵素F1をHis-Tagを使用してガラス表面に固定し、その回転運動を観察した。大腸菌F1のaサブユニットに遺伝子工学の手法を用いてHis-Tagを導入した。gサブユニットに導入したシステインはビオチン化の後、ストレプトアビジンを介してビオチン化蛍光標識アクチンフィラメントと結合させた。スペーサーとなる蛋白質を介さずに、直接Ni-NTAをガラス表面に結合させても、F1の活性は失われていなかったことを示す。また、回転速度のアクチンフィラメント長さ依存性を計測し、F1の回転トルクを計測したところ、いままで報告されている値とほぼ同様な値が得られた。

我们利用近场照明进行研究，目的是可视化单个蛋白质分子的酶促反应，并同时对与之相关的物理反应（旋转和滑动）进行成像。当将近场照明应用于生物样品的荧光观察时，将样品固定到玻璃表面成为一个问题。观察活体样本的必要条件是对蛋白质分子影响很小。牢固的粘合和易于操作也很重要。今年，我们尝试使用 His-Tag 将蛋白质分子固定在玻璃表面，作为满足这些条件的方法。为了将Ni-NTA键合到玻璃表面，将SH基引入玻璃表面，然后键合具有键合氨基的NTA（AB-NTA，Dojin）。使用His-Tag将ATP水解酶F1固定在玻璃表面，并观察其旋转运动。使用基因工程技术将 His-Tag 引入大肠杆菌 F1 的 a 亚基中。引入g亚基的半胱氨酸被生物素化，然后通过链霉亲和素与生物素化的荧光标记的肌动蛋白丝结合。这表明，即使当Ni-NTA直接结合到玻璃表面而不插入间隔蛋白时，F1的活性也没有丧失。此外，当我们测量旋转速度对肌动蛋白丝长度的依赖性并测量F1的旋转扭矩时，我们获得的值与迄今为止报道的值几乎相同。