肝星細胞の三次元培養による脂肪肝炎治療薬の新規スクリーニング系の開発

利用肝星状细胞三维培养开发新型脂肪性肝炎治疗药物筛选系统

基本信息

批准号：
22K12793
负责人：
石田誠一
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Sojo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

非アルコール性脂肪肝炎が原因となる肝線維化を伴う肝硬変の病状の進行は予測が困難であるため、肝線維化を模倣したスクリーニング系の開発が望まれている。一方、肝星細胞は、肝線維化の責任細胞として注目されており、正常な静止星細胞(qHSC)から活性化状態（aHSC）への変化が肝線維化の原因であるものの、通常の2D培養では常にaHSCが維持されているため、現在この変化を実現できる培養系が存在しない。そこで、本研究ではqHSCの安定供給を目的とした3D培養法の開発について検討した。また、本研究では、肝星細胞と似た特徴を持つLI90細胞を様々な培養基材で培養することで、NASH治療薬開発や肝硬変を誘起する医薬品副作用の評価系に資する活性化/脱活性化の制御が可能な培養系の構築を目的としている。R4年度は下記の研究成果を得た。1)F-actinの蛍光は、monolayer培養では線維状に伸長していることが確認でき、三次元培養（スフェロイド）ではF-actinが伸長していないことが示され、スフェロイドでは活性化していないことが示唆された。2)静止期星細胞では、細胞質内にビタミンAであるレチノイドを含む脂肪滴を多く持ち、活性化状態となった肝星細胞は細胞質の脂肪滴を失う。EZSPHERE、NanoCulture Plateを用いた三次元培養（スフェロイド）ではビタミンAに由来する蛍光が観察でき、脱活性化していることが示された。3)活性化マーカーであるα-SMAの免疫染色の結果、スフェロイドのα-SMA蛍光強度は、monolayerと比較して弱くなり、LI90細胞は三次元培養により脱活性化することが示された。4)スフェロイドのαSMAの遺伝子発現は、monolayerと比べ低下することが示され、脱活性化することが示唆された。

由于难以预测伴随肝纤维化的非酒精性脂肪性肝炎引起的肝硬化的进展，因此需要开发模拟肝纤维化的筛查系统。另一方面，肝星状细胞作为导致肝纤维化的细胞而受到关注，虽然从正常静止星状细胞（qHSC）到激活状态（aHSC）的变化是肝纤维化的原因，但正常的2D由于aHSC始终保持在文化方面，目前还没有一个文化体系能够实现这种改变。因此，在本研究中，我们研究了3D培养方法的开发，以稳定供应qHSC。此外，在本研究中，通过在各种培养基中培养具有与肝星状细胞相似的特性的LI90细胞，我们将进行激活/失活，这将有助于NASH疗法的发展以及药物副作用的评估系统本研究的目的是构建一个可以控制变化速度的培养系统。在R4年，我们获得了以下研究成果。 1)F-肌动蛋白荧光被证实在单层培养中以纤维状方式伸长，并且在三维培养(球状体)中，F-肌动蛋白不被伸长，并且在球状体中未被激活。 2）静息期星状细胞的细胞质中有许多含有类维生素A（维生素A）的脂滴，而激活状态的肝星状细胞则失去细胞质脂滴。在使用EZSPHERE和NanoCulture Plate的三维培养（球体）中，可以观察到源自维生素A的荧光，表明其已失活。 3)激活标记物α-SMA免疫染色显示，球状体中α-SMA的荧光强度较单层细胞弱，表明三维培养后LI90细胞失活。 4) 球状体中的αSMA基因表达低于单层细胞中的表达，表明其失活。