生細胞で二次メッセンジャー濃度を自由自在に制御する手法の開発と応用

自由控制活细胞中第二信使浓度的方法的开发和应用

基本信息

批准号：
22K19401
负责人：
白川英樹
金额：
$ 4.16万
依托单位：
The University of Electro-Communications
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

光応答性イノシトール三リン酸（IP3）合成酵素作成のベースとなるタンパク質として、ホスホリパーゼＣゼータ（PLCz）の構造機能相関を精査した結果、これまで活性に必須であるとされていたEFドメインを除去してもIP3産生活性を維持できることを見出した。またＸとＹドメイン間のリンカー領域で切断した分割型PLCzも、共発現させると活性が回復することを確認した。しかし、分割型PLCzのそれぞれに青色光光受容タンパク質pMagとnMag、または赤色光受容タンパク質PhyBとその結合タンパク質PIIFを付加したものを共発現させた場合、青色光または赤色光を照射した際にIP3産生の有意な増加を示す細胞内Ca2+濃度上昇応答は確認されなかった。一方、IP3分解酵素であるIP3-5-ホスファターゼA（IPP5A）の細胞膜局在化配列を除去した変異体を作成したところ、野生型にくらべPLCｚによって誘発されるCa2+濃度上昇応答に対する抑制作用が強く、細胞内IP3分解効率が高いことが示唆されたため、この変異型IPP5Aを光応答性IP3分解酵素作成のベースとして用いることとした。蛍光性IP3センサーの改良については、蛍光タンパク質CFPとYFP、およびI型IP3受容体のIP3結合部位からなるFRET型のセンサータンパク質をベースに、各蛍光タンパク質の循環置換型変異体を用いたものや、IP3結合部位内またはIP3結合部位と蛍光タンパク質間のリンカー長の異なるものを作成したところ、IP3結合部位内に15アミノ酸を付加したものでFRETシグナルのIP3依存的変化率に若干の向上か見られた。これに対し、蛍光タンパク質をTagGFP2とTagRFP, CloverとmRuby2に置き換えた場合には、IP3依存的シグナル変化がほぼ消失するという結果となった。

通过检查磷脂酶 C zeta (PLCz)（一种构成光响应性肌醇三磷酸 (IP3) 合酶产生基础的蛋白质）的结构与功能关系，我们去除了 EF 结构域，该结构域曾被认为是我们发现，即使在以下情况下，IP3 的生产活动也能得以维持。我们还证实，在 X 和 Y 结构域之间的连接区处切割的分裂型 PLCz 的活性在共表达时得以恢复。然而，当蓝光受体蛋白pMag和nMag，或红光受体蛋白PhyB及其结合蛋白PIIF在每个分裂型PLCz中共表达时，当用蓝光或红光照射时，IP3没有响应增加细胞内Ca2+浓度表明观察到产量显着增加。另一方面，当我们创建了IP3降解酶IP3-5-磷酸酶A（IPP5A）的细胞膜定位序列被删除的突变体时，它对诱导的Ca2+浓度增加反应具有更强的抑制作用。由于PLCz的细胞内IP3降解效率较高，因此我们决定使用该突变体IPP5A作为创建光响应性IP3降解酶的基础。荧光 IP3 传感器的改进基于由荧光蛋白 CFP 和 YFP 组成的 FRET 型传感器蛋白以及 I 型 IP3 受体的 IP3 结合位点，以及使用每种荧光蛋白的圆形排列突变体的技术。在IP3结合位点内或IP3结合位点与荧光蛋白之间，我们发现在IP3结合位点添加15个氨基酸可以稍微提高FRET信号中IP3依赖性变化的速率。另一方面，当荧光蛋白被替换为TagGFP2、TagRFP、Clover和mRuby2时，IP3依赖性信号变化几乎消失。