Identification and analysis of the structure-function relationship of eukaryotic glycolipids involved in protein sorting and insertion into membanes

参与蛋白质分选和插入膜的真核糖脂的结构-功能关系的鉴定和分析

• 批准号: 22K19262
• 负责人: 西山 賢一
• 金额: $ 4.08万
• 依托单位: Iwate University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19262/
• 关键词: タンパク質膜挿入; 細胞内選別輸送; リポソーム; MPIase; 小胞体; ミトコンドリア

タンパク質が細胞質で生合成されたのち、それらが機能を発揮する場所に輸送され局在化する。この分子機構については概ね明らかにされているが、一部の膜タンパク質の選別輸送・膜挿入機構が未解明である。申請者らは、モデル生物大腸菌のタンパク質膜挿入機構を研究し、膜挿入に必須の糖脂質MPIaseを発見した。タンパク質膜挿入機構は基本的にすべての生物で保存されているため、真核生物でもMPIase様の機能をもつ物質が存在する可能性を着想した。ヒト由来のHeLa細胞からミトコンドリアや小胞体を分画し、MPIaseと同様の抽出により、膜挿入活性を示す糖脂質が得られた。本研究では、まず、使用細胞や細胞分画法の検討を行った。その結果、HeLa細胞をホモジナイザーで破砕し、分画するともっとも効率よくMPIaseホモログの抽出が可能であることが判明した。HeLa細胞は凍結しても新鮮なものを用いても同様の抽出効率であった。ミトコンドリアと小胞体からMPIaseホモログを単離・精製し、選別輸送・膜挿入に関与することを示す。各オルガネラのMPIaseホモログを抽出し、リポソームに再構成したところ、小胞体タンパク質（Cytochrome b5）は小胞体抽出物を含むリポソームに、ミトコンドリアタンパク質（Tom5）はミトコンドリア抽出物を含むリポソームに効率よく膜挿入した。これらの結果は、MPIaseホモログによりタンパク質選別輸送・膜挿入が達成されたことを示している。現在、構造解析に十分な量（目標数ミリグラム）のMPIaseホモログの精製を進めている。

蛋白质在细胞质中生物合成后，被运输并定位到发挥其功能的位置。尽管这种分子机制已基本阐明，但一些膜蛋白的选择性转运和膜插入机制仍然未知。申请人研究了模式生物大肠杆菌的蛋白质膜插入机制，并发现了膜插入所必需的糖脂MPI酶。由于蛋白质膜插入机制在所有生物体中基本上都是保守的，因此我们提出了真核生物中也存在具有MPIase样功能的物质的可能性。通过与 MPIase 相同的方式分离人 HeLa 细胞的线粒体和内质网并提取它们，获得表现出膜插入活性的糖脂。在本研究中，我们首先研究了所使用的细胞和细胞分级分离方法。结果发现，通过使用均质器破碎 HeLa 细胞并对其进行分级，可以最有效地提取 MPIase 同源物。无论 HeLa 细胞是冷冻的还是新鲜的，提取效率相似。我们从线粒体和内质网中分离和纯化了 MPIase 同源物，并表明它们参与选择性转运和膜插入。当从每个细胞器中提取MPIase同源物并将其重构为脂质体时，内质网蛋白（细胞色素b5）被有效地插入到含有内质网提取物的脂质体的膜中，并且线粒体蛋白（Tom5）被有效地插入到含有线粒体提取物的脂质体中。这些结果表明蛋白质选择性转运和膜插入是通过 MPIase 同源物实现的。我们目前正在纯化足够数量的 MPIase 同系物（目标为几毫克）以进行结构分析。

项目成果

Role of a bacterial glycolipid in Sec-independent membrane protein insertion

细菌糖脂在不依赖于 Sec 的膜蛋白插入中的作用

• DOI: 10.1038/s41598-022-16304-1
• 发表时间: 2022
• 作者: Nomura K; Mori S; Fujikawa K; Osawa T; Tsuda S; Yoshizawa
• 通讯作者: Yoshizawa

膜挿入基質タンパク質GFP-Tom5の精製

插膜底物蛋白 GFP-Tom5 的纯化

• 发表时间: 2022
• 作者: 木村 樹南;森 祥子;藤川 紘樹;島本 啓子;西山 賢一
• 通讯作者: 西山 賢一

Intermolecular Interactions between a Membrane Protein and a Glycolipid Essential for Membrane Protein Integration

膜蛋白和糖脂之间的分子间相互作用对于膜蛋白整合至关重要

• DOI: 10.1021/acschembio.1c00882
• 发表时间: 2022
• 影响因子: 4
• 作者: Mori Shoko;Nomura Kaoru;Fujikawa Kohki;Osawa Tsukiho;Shionyu Masafumi;Yoda Takao;Shirai Tsuyoshi;Tsuda Shugo;Yoshizawa;Masuda Shun;Nishio Hideki;Yoshiya Taku;Suzuki Sonomi;Muramoto Maki;Nishiyama Ken;Shimamoto Keiko
• 通讯作者: Shimamoto Keiko

ヒト細胞を用いた真核生物のタンパク質膜挿入因子 MPIaseホモログの探索

使用人类细胞寻找真核蛋白膜插入因子 MPIase 同源物

• 发表时间: 2023
• 作者: 日景 瑠那;Pattama Wiriyasemkul;永森 收志;西山 賢一
• 通讯作者: 西山 賢一

MPIase生合成酵素の探索

寻找MPIase生物合成酶

• 发表时间: 2022
• 作者: 澁谷 まゆ;Han Youjung;大澤 月穂;藤川 紘樹;島本 啓子;西山 賢一
• 通讯作者: 西山 賢一