時空間制御CRISPR-Cas3の開発および生体内ゲノム改変への応用

时空控制CRISPR-Cas3的开发及其在体内基因组修饰中的应用

• 批准号: 22K19238
• 负责人: 吉見 一人
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19238/
• 关键词: CRISPR-Cas3; 時空間制御システム; 光制御システム; ゲノム編集; マウス

真核細胞における新規ゲノム編集ツールとして我々が開発したCRISPR-Cas3システムは、数百～数kbの広範な欠失変異を導入するというこれまでにない特徴を有しており、独自性、発展性に富んだ国産ゲノム編集技術として期待されている。しかし、精密にCRISPR-Cas3を制御するシステムがなく、生体内でのゲノム編集機能も未知である。そこで本研究では、低侵襲、高効率、高精度にCRISPR-Cas3を時空間的制御するシステム基盤および動物モデルの構築を目指した。本年度は、時空間制御CRISPR-Cas3プラットフォームの構築研究を実施した。薬剤特異性にゲノム編集活性を制御するため、第三世代Tet-onシステムを用いて、薬剤誘導性CRISPR-Cas3システムを構築した。実際にヒト細胞に導入した結果、ゲノム編集活性のリークがみられない一方、ドキシサイクリン投与時に高効率でKOすることができる実験系の確立に成功した。また本システムを生体内で実施するため、本コンストラクトをRosa領域に導入したラットの作製に成功した。更なる精密な時空間制御を行うため、分担者が開発してきた青色光照射によりタンパク質を結合できる光スイッチシステムと、分割化したCRISPR-Cas3を組み合わせたPA-Cas3システムの開発も目指している。本年度は、光依存的に活性を示す可能性のあるCRISPR-Cas3内でのスプリットポジションについて、結晶構造情報を用いたin silico解析により、約30か所同定した。

我们开发的CRISPR-Cas3系统作为一种新型的真核细胞基因组编辑工具，具有前所未有的特点，可以引入数百至数kb的大范围缺失突变，并且具有独特性和可扩展性。具有诸多优势的国产基因组编辑技术。然而，目前还没有精确控制CRISPR-Cas3的系统，其体内基因组编辑功能尚不清楚。因此，本研究旨在构建微创、高效、高精度的时空调控CRISPR-Cas3的系统平台和动物模型。今年，我们进行了研究，构建了时空控制的CRISPR-Cas3平台。为了以药物特异性方式控制基因组编辑活性，我们使用第三代Tet-on系统构建了药物诱导的CRISPR-Cas3系统。当导入人体细胞时，没有观察到基因组编辑活性的泄漏，并成功建立了一个实验系统，在施用多西环素时可以高效地实现KO。此外，为了在体内实施该系统，我们成功地创建了大鼠，并将该结构引入罗莎区域。为了实现更精确的时空控制，他们还致力于开发一种PA-Cas3系统，该系统结合了研究人​​员开发的光学开关系统，可以通过蓝光照射与分段的CRISPR-Cas3结合蛋白质。今年，我们通过使用晶体结构信息进行计算机分析，确定了 CRISPR-Cas3 中大约 30 个分裂位置，这些位置可能表现出光依赖性活性。

项目成果

Mechanisms of CRISPR-Cas3 mediated DNA breaks and its application for genome editing in embryos

CRISPR-Cas3介导的DNA断裂机制及其在胚胎基因组编辑中的应用

• 发表时间: 2023
• 作者: Yoshimi Kazuto; Takeshita Kohei; Noriyuki Kodera; Yamauchi Yuko; Hattori Kosuke; Yamamoto Masaki; Mashimo Tomoji
• 通讯作者: Mashimo Tomoji

The role of cell-autonomous circadian oscillation of Cry transcription in circadian rhythm generation

Cry转录的细胞自主昼夜振荡在昼夜节律产生中的作用

• DOI: 10.1016/j.celrep.2022.110703
• 发表时间: 2022
• 影响因子: 8.8
• 作者: Matsumura Ritsuko;Yoshimi Kazuto;Sawai Yuka;Yasumune Nanami;Kajihara Kohhei;Maejima Tatsuya;Koide Tsuyoshi;Node Koichi;Akashi Makoto
• 通讯作者: Akashi Makoto

タイプI-E CRISPR-Cas3による標的二本鎖DNA切断機構の解明

I-E型CRISPR-Cas3阐明靶标双链DNA切割机制

• 发表时间: 2022
• 作者: 吉見 一人; 竹下 浩平; 古寺 哲幸; 渋村 里美; 山内 祐子; 山本 雅貴; 真下知士
• 通讯作者: 真下知士

CRISPR-Cas3システムによるゲノム編集－国産ゲノム編集技術の再生医療への挑戦

使用CRISPR-Cas3系统进行基因组编辑——国产基因组编辑技术对再生医学的挑战

• 发表时间: 2023
• 作者: 渡辺祥司;吉見一人;真下知士
• 通讯作者: 真下知士

A high-quality severe combined immunodeficiency (SCID) rat bioresource.

高质量的严重联合免疫缺陷 (SCID) 大鼠生物资源。

• DOI: 10.1371/journal.pone.0272950
• 发表时间: 2022
• 影响因子: 3.7
• 作者: Yoshiki Miyasaka; Jinxi Wang; Kosuke Hattori; Yuko Yamauchi; Miho Hoshi; Kazuto Yoshimi; Saeko Ishida; Tomoji Mashimo
• 通讯作者: Tomoji Mashimo