Understanding of cholesterol transporter mechanisms via HS-AFM and computational modeling

通过 HS-AFM 和计算模型了解胆固醇转运机制

基本信息

批准号：
22KF0153
负责人：
古寺哲幸
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

当該年度は、脂質膜のナノディスクに埋め込んだコレステロール輸送タンパク質の高速AFM観察と、その機能メカニズムを詳細に理解するために計算科学的な手法をAFMの画像解析に取り入れるための研究開発を行った。観察対象であるコレステロール輸送タンパク質のヌクレオチド結合ドメイン、コレステロールを蓄積するエクストラセルラードメインを明瞭に可視化するために、AFM観察基板面と垂直に脂質膜が配置するような分子の固定法を開発した。タンパク質タグやそれに結合する小分子、溶液条件を検討することで、目標としていた配置で分子を効率よく固定することができるようになった。その観察基板を用いて高速AFM観察を行った結果、ATP依存的に、目的のタンパク質の構造形態変化を捉えることができた。これらの観察結果を高速AFMの時間・空間分解能を超えて解釈するために、計算科学的な手法を取り入れた。はじめに、Protein Data Bankに登録されている対象の分子の原子レベルのモデル構造にAFMの探針効果を入れて疑似AFM像を作成し、そこで得られた像が実際の高速AFMで観察した分子の形状が最も相関する分子の固定のされ方を比較した。ここで2つの画像（疑似AFM像と高速AFM像）に高い類似性を見出すことができた。さらに、タンパク質表面と観察基板の電荷分布を考慮して、分子がどのように配向すると最も安定に基板表面に固定されるかを計算する手法の開発に取り組んだ。これにより、AFMで観察されている分子の配向が理論的にもサポートされることが期待される。

在本财年，我们进行了将计算科学方法融入AFM图像分析的研究和开发，以便对嵌入脂质膜纳米盘中的胆固醇转运蛋白进行高速AFM观察并详细了解其功能机制。为了清楚地观察胆固醇转运蛋白的核苷酸结合结构域和积累胆固醇的细胞外结构域，我们开发了一种固定分子的方法，其中脂质膜垂直于AFM观察基板的表面放置。通过研究蛋白质标签、与其结合的小分子以及溶液条件，可以有效地将分子固定在目标构型中。使用该观察基质进行高速 AFM 观察的结果是，我们能够捕获目标蛋白质中依赖于 ATP 的结构和形态变化。为了超越高速原子力显微镜的时间和空间分辨率来解释这些观察结果，我们采用了计算科学方法。首先，将AFM尖端效应融入蛋白质数据库中注册的目标分子的原子级模型结构中，创建伪AFM图像，所得图像与实际高速观察到的分子相似AFM。我们比较了形状最相关的分子的固定方法。在这里，我们能够发现两个图像（伪 AFM 图像和高速 AFM 图像）之间的高度相似性。此外，我们致力于开发一种方法，该方法考虑蛋白质表面和观察基板的电荷分布，并计算将它们最稳定地固定在基板表面上的分子的方向。这有望为AFM观察到的分子取向提供理论支持。