An in vitro/in vivo system for targeted retinal ganglion cell subtype manipulation

用于靶向视网膜神经节细胞亚型操作的体外/体内系统

基本信息

  • 批准号:
    10546443
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 20万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2022
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2022-02-01 至 2025-01-31
  • 项目状态:
    未结题

项目摘要

PROJECT SUMMARY Glaucoma is characterized by the gradual degeneration of retinal ganglion cells (RGCs). RGCs are highly heterogeneous, and greater than 40 RGC subtypes in the mouse retina have been identified. Currently, our understanding of RGC subtypes is hindered by the general inaccessibility of RGCs due to their small number. Therefore, techniques that enrich the population of viable adult RGCs and RGC subtypes for experimentation, such as immunopanning, are of great value. In this new application, we will develop a novel in vitro/in vivo system for targeted RGC subtype manipulation based on modifications of the immunopanning technique. Our overall hypothesis is that Cre-dependent ectopic expression of avian tumor virus receptor A (TVA) in RGCs and RGC subtypes will allow for the isolation and culture of highly purified RGC populations. This will be achieved through TVA-mediated immunopanning (TVAMI), a new technique we will develop which integrates a positive immunopanning step based on protein binding to TVA. Furthermore, through transduction with lentivirus pseudotyped with EnvA, a selective TVA ligand, we will attempt to induce gene expression in the same TVA-expressing RGC populations both in vitro and in vivo. There are two Specific Aims: 1) establish and optimize the TVAMI system for RGC isolation and culture; and 2) manipulate gene expression in targeted RGC subpopulations. Throughout Aim 1, we will study transgenic mice that express TVA on the cell surface of nearly all adult RGCs. We will compare several TVAMI variations against standard immunopanning both after isolation and one week of cell culture with cell staining and immunocytochemistry to develop an optimized protocol. Throughout Aim 2, we will study transgenic animals that express TVA in αRGCs, a population of RGCs which includes four RGC subtypes. First, we will isolate αRGCs with TVAMI and confirm the identity, validate the purity, and measure the relative survival of the four αRGC subtypes after isolation and one week of cell culture with cell staining and immunocytochemistry. We will also perform single cell RNA sequencing on this enriched population to define the transcriptional signature of αRGCs. Second, after αRGC isolation, we will assess the specificity and efficiency of αRGC-specific virus transduction in vitro with EnvA-pseudotyped lentivirus or AAV2 vector containing an RGC-specific GFP expression cassette. Third, we will introduce the same viruses to RGCs via intravitreal injection and compare rates of αRGC transduction in vivo with immunohistochemistry in whole mounted and sectioned retinas and after subsequent TVAMI. If successful, this system has the potential to unlock multiple new approaches to study RGCs and RGC subtypes in normal and disease states, and enable a broad range of novel applications with potential therapeutic value.
项目概要 青光眼的特征是视网膜神经节细胞(RGC)高度逐渐退化。 目前,我们已在小鼠视网膜中发现了 40 多种 RGC 亚型。 由于 RGC 数量较少,一般难以接近,这阻碍了对 RGC 亚型的了解。 因此,丰富可存活的成年 RGC 和 RGC 亚型群体的技术用于实验, 在这个新应用中,我们将开发一种新型的体外/体内方法。 基于我们的免疫淘选技术改进的靶向 RGC 亚型操作系统。 总体假设是,RGC 中禽肿瘤病毒受体 A (TVA) 依赖于 Cre 的异位表达 RGC 亚型将允许分离和培养高度纯化的 RGC 群体。 通过 TVA 介导的免疫淘选 (TVAMI) 实现,这是我们将开发的一项新技术,它集成了 基于蛋白质与 TVA 结合的阳性免疫淘选步骤此外,通过转导。 用 EnvA(一种选择性 TVA 配体)假型慢病毒,我们将尝试在 体外和体内表达相同 TVA 的 RGC 群体有两个具体目标:1) 建立和 优化用于 RGC 分离和培养的 TVAMI 系统;2) 操纵目标 RGC 中的基因表达 在整个目标 1 中,我们将研究在细胞表面表达 TVA 的转基因小鼠。 几乎所有成人 RGC 都会在之后将几种 TVAMI 变异与标准免疫淘选进行比较。 分离并通过细胞染色和免疫细胞化学进行一周的细胞培养,以开发优化的 在整个目标 2 中,我们将研究在 αRGC(一群 αRGC)中表达 TVA 的转基因动物。 RGC 包括四种 RGC 亚型,首先,我们将用 TVAMI 分离 αRGC 并确认身份, 验证纯度,并测量四种 αRGC 亚型分离后一周的相对存活率 我们还将使用细胞染色和免疫细胞化学对细胞培养物进行单细胞 RNA 测序。 这个丰富的群体定义了 αRGC 的转录特征 其次,在 αRGC 分离后,我们将。 使用 EnvA 假型评估 αRGC 特异性病毒体外转导的特异性和效率 含有RGC特异性GFP表达盒的慢病毒或AAV2载体第三,我们将介绍RGC特异性GFP表达盒。 通过玻璃体内注射相同的病毒至 RGC,并比较体内 αRGC 转导率 在整个安装和切片的视网膜中以及随后的 TVAMI 后进行免疫组织化学如果成功,则这。 系统有潜力解锁多种新方法来研究正常和不同状态下的 RGC 和 RGC 亚型 疾病状态,并实现具有潜在治疗价值的广泛新应用。

项目成果

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