The Analysis of the mechanisms of the aging-mediated accumulation of CADASIL-mutated NOTCH3 protein

CADASIL突变NOTCH3蛋白衰老介导的积累机制分析

基本信息

批准号：
22KJ0484
负责人：
鈴木翔大
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0484/
关键词：
CADASIL 細胞老化脳微小環境 Notchシグナル糖鎖修飾 Fringe ペリサイト

项目摘要

本年度は1. シングルセルRNA-seqデータベースを用いたマウス血管細胞におけるFringeおよびNotchリガンドの発現確認、2. 不死化ペリサイト細胞株HBPC/ci37の老化モデルの確立、3. CRISPRによるCADASIL型NOTCH3変異の導入を行った。1. 公的に公開されている、マウス血管細胞を用いたシングルセルRNA-seqデータベース(Vanlandewijck et al., Nature, 2018)からNOTCHリガンドであるDLL, JAGリガンドおよび、糖転移酵素Fringeファミリーの発現を血管細胞種ごとに比較した。血管内皮細胞ではDLL4やJAG1の発現が見られたが、ペリサイトや血管平滑筋細胞といった血管壁細胞ではDLL4の発現は見られずJAG1の発現が見られた。さらにRadical fringeがNOTCH3と同時に血管壁細胞で発現していることが明らかになった。以上からNOTCH3変異タンパクの蓄積に関わる細胞間相互作用が予測できた。2. HBPC/ci37を無血清培地で1日, 7日, 14日間培養後に老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)染色, 各種老化マーカーのqPCRを行った。その結果, 培養期間の延長に伴いSA-β-gal染色細胞の割合の増加やp21の発現上昇が見られた。よって, HBPC/ci37を無血清培地で14日間培養することで老化環境を模倣できた。3. HBPC/ci37の内在NOTCH3遺伝子にCADASIL型変異の1つであるC49Yの導入を行った。C49Yの点変異を挿入したcrRNAをtracrRNA、Cas9タンパク質とともにHBPC/ci37にエレクトポレーションをした。細胞からゲノムを回収して点変異を導入した領域をPCR増幅してシーケンス解析を行った。その結果、点変異の導入効率が約30%程度だった。

今年，我们将1.利用单细胞RNA-seq数据库确认小鼠血管细胞中Fringe和Notch配体的表达，2.建立永生化周细胞系HBPC/ci37的衰老模型，3.CADASIL-引入了使用 CRISPR 的 NOTCH3 型突变。 1. 使用小鼠血管细胞（Vanlandewijck 等人，Nature，2018）公开的单细胞 RNA-seq 数据库中的 NOTCH 配体 DLL、JAG 配体和糖基转移酶 Fringe 家族的表达，对每种血管细胞类型进行了比较。在血管内皮细胞中观察到DLL4和JAG1的表达，但在周细胞和血管平滑肌细胞等血管壁细胞中未观察到DLL4的表达，但观察到JAG1的表达。此外，还表明Radical fringe与NOTCH3同时在血管壁细胞中表达。综上所述，我们能够预测涉及 NOTCH3 突变蛋白积累的细胞间相互作用。 2. HBPC/ci37在无血清培养基中培养1、7和14天后，进行衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色和各种衰老标志物的qPCR。结果，随着培养时间的延长，SA-β-gal染色的细胞百分比增加，p21的表达增加。因此，可以通过在无血清培养基中培养 HBPC/ci37 14 天来模拟老化环境。 3. C49Y是CADASIL型突变之一，被引入HBPC/ci37的内源NOTCH3基因中。将含有C49Y点突变的crRNA与tracrRNA和Cas9蛋白一起电穿孔至HBPC/ci37中。从细胞中收集基因组，通过 PCR 扩增引入点突变的区域并进行测序。结果，点突变引入的效率约为30％。