ハイブリッドエピゲノム編集法によるin vitro精子形成技術の開発

利用混合表观基因组编辑方法开发体外精子发生技术

• 批准号: 22KJ2818
• 负责人: 多田羅 麻由
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Tokyo University of Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2818/
• 关键词: 生殖細胞; エピゲノム編集; クロマチン; 精子形成; エピジェネティクス; 分化

本研究では、エピゲノム編集技術を用いた胚性幹細胞から精母細胞への分化誘導法の確立を目的とする。哺乳類の精子形成では、減数分裂期へ移行する際に体細胞型の遺伝子発現プロファイルから精子形成期特有の遺伝子発現プロファイルへと切り替わる。申請者は、マウス精子形成をモデルにこの大規模な遺伝子発現変化が減数分裂移行期の段階的なクロマチン構造変化によってもたらされることを明らかにした。次に、この精子形成の進行に重要なクロマチン動態が生物種間で保存された現象なのかという点に着目した。さらに、種間で共通して精子形成の進行に重要な領域を標的に、人為的に体細胞分裂型から減数分裂型のクロマチン状態に編集することで、in vitroで減数分裂への移行を制御できるのではと考えた。そこで本研究ではまず、抑制型及び活性化型のエピゲノム編集を同時に行う新規のエピゲノム編集技術の確立を進めた。本項目では、ddCas12aを用いたCRISPRoff法による抑制型およびdCas9を用いたCRISPRa法による活性化型のエピゲノム編集を行うためのプラスミドベクターを作製し、CRISPRoff、CRISPRa融合タンパク質の活性をレポーターアッセイにより評価する。現在までに、ddAsCas12aを用いたCRISPRoff法による抑制生のエピゲノム編集を行うためのプラスミドベクターを作製した。作製したCRISPRoffベクターをHEK293FT培養細胞にトランスフェクションし、抗HA抗体を用いたウェスタンブロッティング法によりCRISPRoff融合タンパク質の発現を確認した。

本研究的目的是建立一种利用表观基因组编辑技术诱导胚胎干细胞分化为精母细胞的方法。在哺乳动物精子发生中，在向减数分裂期过渡期间，存在从体细胞型基因表达谱到生精期特有的基因表达谱的转变。申请人以小鼠精子发生为模型，揭示了这种大规模的基因表达变化是由减数分裂过渡期染色质结构的逐渐变化带来的。接下来，我们关注对精子发生过程很重要的染色质动力学是否是物种间的保守现象。此外，我们通过靶向跨物种常见且对精子发生进展重要的区域，并通过人工编辑染色质状态从体细胞到减数分裂状态，在体外控制了向减数分裂的转变，我认为这是可能的。因此，在本研究中，我们首先建立了一种新的表观基因组编辑技术，可以同时进行抑制和激活表观基因组编辑。在本节中，我们将使用 ddCas12a 使用 CRISPRoff 方法创建质粒载体，并使用 dCas9 使用 CRISPRa 方法激活表观基因组编辑，并通过报告基因测定评估 CRISPRoff 和 CRISPRa 融合蛋白的活性。迄今为止，我们已经使用 ddAsCas12a 使用 CRISPRoff 方法创建了用于抑制性表观基因组编辑的质粒载体。将制备的CRISPRoff载体转染至HEK293FT培养细胞中，并使用抗HA抗体通过Western blotting证实CRISPRoff融合蛋白的表达。