人工制限酵素の合成と新規バイオテクノロジーへの応用

人工限制性内切酶的合成及其在新生物技术中的应用

基本信息

批准号：
08750919
负责人：
須磨岡淳
金额：
$ 0.7万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08750919/
关键词：
人工制限酵素セリウムリン酸ジエステル DNA 加水分解

项目摘要

DNAを任意の位置で切断する人工材料に関して種々の研究が盛んに行われているが、リン酸ジエステルの加水分解に対する安定性のため、ラジカルによる酸化的切断を用いたものが大半である。申請者らは、すでに、セリウム(IV)を用いると効率的に2量体DNA中のリン酸ジエステル結合が迅速に加水分解すること、およびターゲットとなる核酸の特定部位と相補的なDNAオリゴマーの5'末端にイミノ二酢酸残基を結合しここにCe(IV)を添加することで塩基配列特異的にDNAを切断することに成功している。本研究では、(1)オリゴマーDNAに対するCe(IV)の切断活性とその切断様式の決定、(2)イミノ二酢酸よりさらに高活性な配位子の探索について検討した。その結果、(1)に対しては、Ce(IV)はオリゴマーDNAに対しても十分活性であり、その切断断片はすべて酵素反応の適用が可能ことが明らかとなった。すなわち、Ce(IV)による切断反応はすべて加水分解で進行しており、Ce(IV)を切断分子として用いる分子設計は、新規なバイオテクノロジーに十分適用可能であること明らかにした。また、(2)に対しては、ある種の糖類を配位子として用いることによりイミノ二酢酸より数十倍以上活性でかつ均一な触媒系の実現にはじめて成功した。したがって、これらの糖を塩基配列認識部位に結合することによって、今までにない高活性な人工ヌクレアーゼが構築可能であることが明らかとなった。

关于可以在任意位置切割 DNA 的人造材料正在积极进行各种研究，但由于磷酸二酯对水解的稳定性，大多数研究都使用自由基进行氧化切割。申请人已经表明，二聚体DNA中的磷酸二酯键可以使用铈(IV)有效且快速地水解，并且与靶核酸的特定位点互补的DNA寡聚物可以通过结合亚氨基二乙酸而有效且快速地水解。将酸性残基添加到 5' 末端并在那里添加 Ce(IV)，我们成功地以碱基序列特异性方式切割 DNA。在本研究中，我们研究了（1）测定Ce（IV）对寡聚DNA的切割活性及其切割模式，以及（2）寻找比亚氨基二乙酸活性更高的配体。结果表明，对于(1)，Ce(IV)对寡聚DNA具有足够的活性，并且其所有切割片段都可以应用于酶促反应。换句话说，所有由Ce(IV)引起的裂解反应都是通过水解进行的，这表明使用Ce(IV)作为裂解分子的分子设计完全适用于新的生物技术。此外，对于（2），我们通过使用某种类型的糖作为配体，首次成功实现了活性比亚氨基二乙酸高数十倍的均相催化剂体系。因此，已经清楚的是，通过将这些糖与碱基序列识别位点结合，可以构建前所未有的高活性人工核酸酶。