タイト結合の機能の制御機構に関する分子解剖学的研究

紧密连接功能调控机制的分子解剖学研究

• 批准号: 08770015
• 负责人: 稲井 哲一朗
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08770015/
• 关键词: タイト結合; occludin; ZO-1

タイト結合の膜蛋白であるoccludinは、N末端とC末端を細胞質側に向け細胞膜を4回貫通する。一方、タイト結合の裏打ち構造を構成する蛋白の一つであるZO-1はoccludinのC末端と結合し、occludinと細胞骨格の結合を仲介していると考えられている。本研究では、MDCK細胞にZO-1のoccludin binding domainのみを過剰発現し、occludinと細胞骨格の連絡を阻害することによりタイト結合に起こる変化を透過型電子顕微鏡およびフリーズフラクチャー法により形態学的に、また、transepithelial electrical resistanceにより機能的に評価することを目的とする。最初に、マウス肺のcDNAライブラリーをスクリーニングしoccludinとZO-1のcDNAの一部を取得した。何れも、5'側の配列が不足していたのでPCRを用いて全長を取得した。次に、occludinの細胞質C末端に相当する領域をpGAD424 vectorに挿入し、マウス肝臓のcDNAをpGAD10 vectorに組み込んで作製したライブラリーをtwo hybrid systemを用いてスクリーニングした。しかし、occludinのC末端と特異的に結合する新たな蛋白質を見い出すことはできなかった。また、ZO-1のcDNAをpGAD10 vectorに組み込んで同様の実験を行ったが結果は得られなかった。そこで、実験系を変更し、in vitro filterbinding assay法により蛋白質相互作用を検討することにした。pGEX vectorにoccludinあるいはZO-1のcDNAを組み込みグルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合蛋白質として大腸菌に発現させ、filter上で蛋白質相互作用を検討する。現在、大腸菌による発現と精製を行っているところである。最近、membrane-associated guanylate kinase homologue familyのPDZ domainが他の蛋白質との結合に重要であることがわかってきた。ZO-1はこのファミリーに属しN末端にPDZ domainを持っており、特にこのdomainに注目して発現ベクターを構築中である。今後、さらに検討が必要である。

Occludin 是一种紧密连接膜蛋白，可穿透细胞膜四次，其 N 和 C 末端面向细胞质。另一方面，ZO-1（构成紧密连接衬里结构的蛋白质之一）被认为与 occludin 的 C 末端结合并介导 occludin 与细胞骨架之间的关联。在本研究中，我们在MDCK细胞中仅过表达ZO-1的occludin结合域，抑制occludin与细胞骨架之间的通讯，并利用透射电子显微镜和冷冻断裂方法观察紧密连接形态的变化。功能评估跨上皮电阻。首先，我们筛选了小鼠肺cDNA文库并获得了occludin和ZO-1的一些cDNA。在这两种情况下，都缺少 5' 序列，因此使用 PCR 来获得全长。接下来，将与occludin的细胞质C末端相对应的区域插入到pGAD424载体中，并使用二杂交系统筛选通过将小鼠肝脏cDNA整合到pGAD10载体中而创建的文库。然而，他们无法找到特异性结合occludin C 末端的新蛋白质。另外，通过将ZO-1 cDNA整合到pGAD10载体中进行了类似的实验，但没有获得结果。因此，我们决定改变实验系统并使用体外过滤结合测定方法检查蛋白质相互作用。将 occludin 或 ZO-1 cDNA 整合到 pGEX 载体中，在大肠杆菌中表达为与谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白，并检查过滤器上的蛋白质相互作用。我们目前正在使用大肠杆菌进行表达和纯化。最近，研究表明膜相关鸟苷酸激酶同源家族的 PDZ 结构域对于与其他蛋白质的结合非常重要。 ZO-1属于该家族，在其N末端有一个PDZ结构域，我们正在构建一个特别关注该结构域的表达载体。未来还需要进一步考虑。