雄性生殖細胞分化過程における分子シャペロンを介したタンパク質輸送の研究

雄性生殖细胞分化过程中分子伴侣介导的蛋白质转运研究

基本信息

  • 批准号:
    08760278
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 0.7万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
  • 财政年份:
    1996
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1996 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

本研究は,精細胞内でCalnexin-1に結合しているタンパクを同定し,そのcDNAのクローニングを行い,ならびにCalnexin-1との結合調整機構を検討,Calnexin-1の小胞体タンパク輸送への関わりを明らかにすることが目的であった。実験目的を簡単に遂行できる系として、申請書(1)Calnexin-1結合タンパクの分離,および(2)Calnexin-1と結合タンパクとの結合様式の検討を同時に行うため,今回はクロスリンカーは用いず精巣をCa2+EGTA,Mg2+,EDTA存在下で別々にホモジナイズし,2種類の抗Calnexin-1抗体(Polyclonalおよび小胞体内腟domainを認識するMonoclonal抗体)カラムによるAffinity chromatographyにより結合複合体回収状況の比較を行った.その結果,Polyclonal抗体カラムでは,上記4条件すべてにおいてCalnexin-1以外の夾雑タンパクが確認できたが,特にEDTA存在下で他の条件で見られない多くのバンドを確認した.回収されるCalnexin-1複合体の総量もこの条件がもっとも多かった.これに対し,Monoclonal抗体カラムでは,EDTA存在条件でのCalnexin-1回収率は他の条件より低く,また他条件ではCalnexin-1以外の夾雑タンパクはほとんど観察されなかった.このMonoclonal抗体はCalnexin-1の内部Porlin-rich repeat配列を認識し,この部位に小胞体タンパクが結合すると予想される.従って上記の結果は,Mg2+のような2価イオン非存在下で,Calnexin-1は他のタンパクと優位に相互作用する可能性を示している.これは体細胞Calnexinで報告された(Ou et al.,1995J Biol Chem 270:18051)Mg2+による構造変化による機構と類似していると推測された.なお,本学において組み換え技術を行使するには予想に反しあまりにも設備的不十分さがあったため,本年度は周辺機器のセットアップを行うにとどまり、(1)-2)Two-Hybridシステムを用いたCalnexin-1結合タンパクcDNAの検出,(3)結合タンパクcDNAとCalnexin-1 cDNAを培養細胞に導入したモデルの確立,は実験行使に至らなかった。
在本研究中,我们鉴定了精子细胞中与Calnexin-1结合的蛋白质,克隆了其cDNA,研究了与Calnexin-1的结合调节机制,并研究了Calnexin-1在内质网蛋白质转运中的作用。澄清关系。作为一个可以轻松实现实验目的的系统,我们没有使用交联剂,以便同时进行(1)Calnexin-1结合蛋白的分离和(2)Calnexin-1与Calnexin-1之间的结合模式的研究结合蛋白Ca。使用两种类型的抗 Calnexin-1 抗体(识别内质网阴道域的多克隆和单克隆抗体)柱进行亲和力分析,在 2+EGTA、Mg2+ 和 EDTA 存在下分别匀浆。我们通过色谱法比较了结合复合物的回收状态。结果,在多克隆抗体柱中,在上述所有四种条件下都确认了除 Calnexin-1 以外的污染蛋白,但特别是在 EDTA 存在的情况下,除 Calnexin-1 以外的污染蛋白在其他条件下观察Calnexin-1也确认了回收的Calnexin-1复合物的总量。这种情况最为常见。另一方面,使用单克隆抗体柱时,EDTA 存在下 Calnexin-1 的回收率低于其他条件,并且在 EDTA 存在下几乎没有观察到除 Calnexin-1 以外的污染蛋白。其他条件。该单克隆抗体是 Calnexin-1 的内部富含 Porlin 的抗体。据预测,Calnexin-1 识别重复序列并结合到该位点,因此,上述结果表明,在不存在二价离子(例如 Mg2+)的情况下,Calnexin-1 主要与其他蛋白质相互作用。 Ou 等人,1995 年《生物化学》杂志270:18051) 推测其机制类似于Mg2+引起的结构变化。与预期相反,我们大学没有足够的设备来使用重组技术,所以今年我们只是设立了(1)-2)检测使用Two-Hybrid系统提取Calnexin-1结合蛋白cDNA,(3)Calnexin-1结合蛋白cDNA和Calnexin-1检测。实验中未建立将cDNA导入培养细胞的模型。

项目成果

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专利数量(0)
大迫誠一郎: "精細胞特異的発現遺伝子の解析" 日本産婦人科学会鹿児島地方部会雑誌. 第4巻. 36-41 (1996)
大迫诚一郎:“精子细胞特异性表达基因的分析”日本妇产科学会鹿儿岛分会杂志第4卷36-41(1996年)。
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