配列データベースを活用した酵素改変法酵素パーツリモデリング法の開発と検証

利用序列数据库和酶部件重构方法开发和验证酶修饰方法

• 批准号: 22KJ2586
• 负责人: 小塚 康平
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: University of Shizuoka
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2586/
• 关键词: 酵素改変; 耐熱性; 生産性; 酵素設計; 高機能化

【コンセンサス設計法を基盤とした酵素パーツリモデリング法の開発】令和4年度までに、コンピュータプログラム言語“Python”を用いて、実行可能なスクリプトのβ版を完成させており、L-スレオニン脱水素酵素 (TDH, NAD+依存型酵素で、L-Thr を基質とし、側鎖のヒドロキシ基の脱水素反応を触媒) を用いて7種類のパーツリモデリング酵素を設計し、ツールの有用性の検証を実験的に行っている。本年度は、上記β版スクリプトの改良を模索した。以下、その詳細について記述する。【１.アミノ酸物理化学的パラメータの加味】対象酵素の類似配列を用いた配列保存性度は、各個数をカウントしたものであり、アミノ酸残基ごとの特徴は全く反映されていない。しかし、酵素を構成する20種類のアミノ酸には性質の違い、例えば疎水性度の高さや電荷の有無などが存在する。そこで、配列保存性度にアミノ酸物理化学的パラメータを加味し、性質の違いを重みとして加えることを検討した。まずは疎水性度に着目し、コンピュータプログラム言語“Python”を用いて、配列保存性度に疎水性度を加味した実行可能なスクリプトを完成させた。【２.前後配列の保存性度の考慮】β版の実行スクリプトは、コンセンサス設計法を基に作られた方法であり、類似配列のアライメント結果から各残基に対して保存性度を考慮する方法である。類似配列のアライメント結果を観察していくと、対象残基周辺にGapが豊富であるなどアライメント精度が高いとは言い難いケースが存在する。アライメント精度が高くない領域において上記実行スクリプトを適用した場合に、アライメント誤差を単に反映してしまう可能性がある。そこで、変異導入を対象とする周辺残基の保存性度を考慮することで、アライメント精度の高い領域においての変異算出を可能にしたスクリプトに拡張した。

[基于共识设计方法的酶部件重塑方法的开发]到2020财年，我们已经完成了使用计算机编程语言“Python”的可执行脚本的测试版，并且我们已经完成了L-苏氨酸脱水的七种部件的设计。使用 TDH 进行重构酶，TDH 是一种 NAD+ 依赖性酶，以 L-Thr 作为底物，催化侧链羟基的脱氢反应，并正在实验中验证该工具的实用性。今年，我们寻求改进上述测试脚本的方法。下面将详细描述。 [1.氨基酸理化参数的添加] 使用目标酶的相似序列的序列保守程度是通过统计每个氨基酸残基的数量来计算的，根本不反映每个氨基酸残基的特征。然而，构成酶的 20 种氨基酸具有不同的特性，例如高疏水性和是否存在电荷。因此，我们考虑在序列保守程度上添加氨基酸理化参数，并在性质差异上添加权重。首先，他们关注疏水性程度，并使用计算机编程语言Python，完成了除了序列保守程度之外还考虑疏水性程度的可执行脚本。 [2.前后序列保守程度的考虑] β版本执行脚本是基于一致性设计方法创建的方法，从相似序列的比对结果中考虑每个残基的保守程度。这是一种方法。当观察相似序列的比对结果时，有时很难说比对精度高，例如当目标残基周围有很多间隙时。当上述执行脚本应用于对准精度不高的区域时，有可能简单地反映对准误差。因此，通过考虑突变引入目标的周围残基的保守程度，我们扩展了脚本以在具有高比对精度的区域中启用突变计算。