Identification of compounds that inhibit the early and late steps of hepatitis E virus infection and analysis of their inhibitory effects on the virus growth

抑制戊型肝炎病毒感染早期和晚期的化合物的鉴定及其对病毒生长的抑制作用分析

• 批准号: 22K07105
• 负责人: 長嶋 茂雄
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07105/
• 关键词: E型肝炎ウイルス; レポーターウイルス; 生物発光タンパク質; HiBiTタグ; ウイルス放出; 薬剤スクリーニング; レポーターアッセイ; 化合物; スクリーニング; 増殖抑制

本研究は、E型肝炎ウイルス (HEV) の感染初期過程と後期過程を阻害する化合物を同定することである。これまでに、HEVのORF1蛋白質（非構造蛋白質）にnanoKAZ遺伝子を搭載した感染性を有するリコンビナントHEVの開発に成功しており、これによりHEVの感染初期過程（吸着および侵入）を阻害する薬剤のスクリーニングが可能となった。本年度は、感染後期過程を阻害する薬剤を同定するための新規スクリーニング系を開発するために、HEVのORF2蛋白質（構造蛋白質）にHiBiTタグを搭載した感染性のリコンビナントウイルスを作製した。ORF2蛋白質にHiBiT配列を挿入した組換えHEV RNAを導入したPLC/PRF/5細胞では、培養上清中に膜に覆われたHEV粒子 (eHEV) が産生され、挿入したHiBiT配列も維持されていた。また、培養上清中のeHEV-HiBiTを新たな細胞に接種したところ、感染性が認められた。ORF2蛋白質に融合したHiBiTは、脂質膜の内側に発現しているが、eHEV-HiBiT粒子を界面活性剤で処理することにより検出が可能であった。そこで、薬剤スクリーニングに応用するために、siRNAを用いて細胞内のTsg101、Rab27A、Hrsをノックダウンした細胞にHEV-HiBiT RNAを導入し、4日後に培養上清中の膜に覆われたHEVをHiBiTシステムにより検出した結果、放出効率の低下が認められた。膜に覆われたHEVは、宿主細胞のエクソソーム分泌経路を利用して細胞外へと放出される。そこで、HEVの放出を阻害する薬剤を同定するために、エクソソーム化合物ライブラリを用いて薬剤スクリーニングを実施した。その結果、HEVの放出を阻害することにより抗HEV活性を示す複数の薬剤を同定することができた。

本研究旨在鉴定可抑制戊型肝炎病毒 (HEV) 感染早期和晚期的化合物。迄今为止，我们已成功开发出具有感染性的重组HEV，其HEV ORF1蛋白（非结构蛋白）中携带nanoKAZ基因，这使得我们能够使用抑制HEV感染初始过程（吸附和侵袭）的药物现在可以进行筛查。今年，为了开发一种新的筛选系统来识别抑制感染后期的药物，我们创建了一种感染性重组病毒，其HEV ORF2蛋白（结构蛋白）上附着有HiBiT标签。在导入了ORF2蛋白中插入了HiBiT序列的重组HEV RNA的PLC/PRF/5细胞中，在培养上清液中产生了膜覆盖的HEV颗粒(eHEV)，并且插入的HiBiT序列也被保留。此外，当将培养上清中的eHEV-HiBiT接种到新细胞中时，观察到感染性。与 ORF2 蛋白融合的 HiBiT 在脂质膜内表达，但可以通过用表面活性剂处理 eHEV-HiBiT 颗粒来检测。因此，为了将其应用于药物筛选，将HEV-HiBiT RNA导入使用siRNA敲除细胞内Tsg101、Rab27A和Hrs的细胞中，4天后在培养上清液中检测到HEV-HiBiT RNA。使用HiBiT系统检测的结果是，观察到释放效率下降。膜封闭的 HEV 通过宿主细胞的外泌体分泌途径释放到细胞外。因此，为了鉴定抑制HEV释放的药物，我们利用外泌体化合物库进行了药物筛选。因此，我们能够鉴定出多种通过抑制 HEV 释放而表现出抗 HEV 活性的药物。

项目成果

Subclinical hepatitis E virus (HEV) infection detected by nucleic acid amplification test on blood donation: short-term positivity for immunoglobulin G class of antibody against HEV

献血核酸扩增检测发现亚临床戊型肝炎病毒（HEV）感染：HEV免疫球蛋白G类抗体短期阳性

• DOI: 10.1007/s12328-022-01635-3
• 发表时间: 2022
• 影响因子: 1
• 作者: Hasegawa Izumi;Nakano Tatsunori;Koguchi Hiroki;Jinno Naruomi;Hirashima Noboru;Nagashima Shigeo;Takahashi Masaharu;Murata Kazumoto;Okamoto Hiroaki
• 通讯作者: Okamoto Hiroaki

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Development and Characterization of Efficient Cell Culture Systems for Genotype 1 Hepatitis E Virus and Its Infectious cDNA Clone

基因型 1 戊型肝炎病毒及其感染性 cDNA 克隆的高效细胞培养系统的开发和表征

• DOI: 10.3390/v15040845
• 发表时间: 2023-03-26
• 作者: Primadharsini PP;Nagashima S;Tanaka T;Jirintai S;Takahashi M;Murata K;Okamoto H
• 通讯作者: Okamoto H