マラリア原虫メロゾイトの細胞内小器官デンスグラニュールタンパク質の網羅的解析

疟原虫裂殖子细胞内细胞器致密颗粒蛋白的综合分析

基本信息

批准号：
22K07041
负责人：
森田将之
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

マラリア原虫の赤血球侵入型であるメロゾイトは赤血球寄生に特化した細胞内小器官を有する。本研究は、その中でも近年の代表者らの研究によってマラリア原虫の侵入や寄生維持に重要な分子が含まれることが見出されてきたデンスグラニュール (DG) の全貌を明らかにすることを目的としている。代表者の予備研究からDGは、RESAが局在するDG、SUB1が局在するDG、それらのどちらも局在しないDG、の少なくとも3種に免疫電子顕微鏡法 (IEM) によって分類できることが分かっており、それらが独自に機能化して原虫の赤血球寄生を緻密に制御していると考えられる。これまでに既知DGタンパク質には6種、また、代表者が独自に同定したDGタンパク質候補が29種あり、前年度はそれらタンパク質のC末端にAGIAタグを融合させてIEMでタンパク質局在を解析するために研究を遂行した。まずエピソーマル発現によって既知DGタンパク質であるPV1にAGIAタグを融合させてマラリア原虫内で発現させたが、免疫蛍光観察によりエピソーマル発現させたPV1-AGIAがDGに局在する結果を得られなかった。本エピソーマル発現系でタンパク質発現に使われるプロモーターは内在性のものとは異なるため、PV1-AGIAが正常に局在しなくなったと考えた。そこで、シングルクロスオーバーによってマラリア原虫ゲノムDNA中のPV1遺伝子にAGIAタグを組込んだ結果、PV1-AGIAは免疫蛍光法およびIEMでDGに局在する結果を得た。RESAとPV1-AGIAを共染色したIEMの結果、PV1-AGIAはRESAと同じDGに局在することが分かった。本方法によって既知DGタンパク質およびDGタンパク質候補へのAGIAタグ融合を進め、2022年度で計10種のタンパク質へのAGIAタグ融合に成功した。

裂殖子是一种侵入红细胞的疟原虫，具有专门用于红细胞寄生的细胞内细胞器。这项研究的目的是澄清致密颗粒（DG）的整体情况，代表性研究人员最近的研究发现，该颗粒含有对疟原虫入侵和维持寄生至关重要的分子。代表人的初步研究表明，使用免疫电子显微镜(IEM)可以将DG分为至少三种类型：RESA局部存在的DG、SUB1局部存在的DG以及两者均不局部存在的DG。独立发挥作用，精确控制原虫对红细胞的寄生。迄今为止，由代表人独立鉴定出的已知DG蛋白有6种，候选DG蛋白有29种。去年，我们将AGIA标签融合到这些蛋白质的C末端，并利用IEM进行了蛋白质定位分析。为了首先，我们将 AGIA 标签与已知的 DG 蛋白 PV1 融合，并通过附加型表达在疟原虫中表达，但免疫荧光观察并未显示附加型表达的 PV1-AGIA 定位于 DG。由于该附加型表达系统中用于蛋白质表达的启动子与内源性启动子不同，我们认为PV1-AGIA没有正常定位。因此，通过单交换将AGIA标签整合到疟原虫基因组DNA中的PV1基因中，通过免疫荧光和IEM将PV1-AGIA定位在DG中。 RESA 和 PV1-AGIA 的 IEM 共染色显示，PV1-AGIA 位于与 RESA 相同的 DG 中。利用该方法，我们继续将AGIA标签与已知的DG蛋白和DG候选蛋白融合，并于2022年成功将AGIA标签与总共10种蛋白质融合。