糸状菌由来ビステトラヒドロフラン環構築に寄与する反復型酸素添加酵素の機能開拓

有助于丝状真菌双四氢呋喃环构建的重复加氧酶的功能发育

基本信息

批准号：
22K06687
负责人：
橋元誠
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Musashino University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06687/
关键词：
生合成糸状菌二次代謝産物フラビン依存酸素添加酵素

项目摘要

糸状菌由来フラビン依存酸素添加酵素（FMO）は、ユニークな反応を行う酵素として注目されてきている。一方、その機能開拓は、基質の酸化とフラビン還元の機能を両立させる必要があるために困難が伴う。本研究は、機能開拓が難しいscFMOを対象として、計算化学に基づいた活性に重要なアミノ酸残基の予測、in vitro解析の併用による機能同定と、単成分系FMOの二成分系FMOへの改変により機能開拓を目指す基礎研究と位置づけできる。本研究ではE. variecolor由来asteltoxinの生合成に関与するFMO（AstE）の機能同定と反応機構の解明、機能拡張を目指した。AstEは、asteltoxin生合成において、2段階のエポキシ化に関与することが予測される。この2つのエポキシ化段階において、関与するアミノ酸残基に違いがあるかについても調査する。今年度はin vitroによる活性評価系の確立を目指した。大腸菌と酵母のコドン使用頻度に最適化した人工遺伝子大腸菌とメタノール資化酵母の発現系について検討した。大腸菌の発現系ではタンパク質の発現が確認できなかったことから、酵母への発現系に切り替えて検討する。また、計算化学ソフトMOE（モルシス社）を利用したAstEの立体予測と、その結果に基づいて作成した点変異酵素の活性評価から、活性に重要なアミノ酸残基について推定した。AstE と補酵素FAD、推定中間体のドッキングシミュレーションを行い、FMOによるエポキシ化部分と補酵素の距離が近いモデルを選抜し、基質に近い酵素（活性中心）のアミノ酸残基を調査した。その結果、複数のアミノ酸残基の候補が上がった。なお、AstEは、2つの異なる生合成段階を酸化することが予想されたことから、それぞれの推定中間体について解析を行った。

源自丝状真菌的黄素依赖性加氧酶（FMO）作为一种执行独特反应的酶而受到关注。另一方面，由于需要平衡底物氧化和黄素还原的功能，因此开发其功能很困难。本研究针对功能开发困难的scFMO，通过基于计算化学预测对活性重要的氨基酸残基，结合体外分析鉴定功能，将单组分FMO修改为双组分FMO，从而可以定位。作为旨在开发新功能的基础研究。在本研究中，我们旨在鉴定 FMO (AstE) 的功能，该 FMO 参与杂色 E. variecolor 的 Asteltoxin 生物合成，阐明反应机制，并扩展其功能。 AstE 预计参与 Asteltoxin 生物合成中的两步环氧化反应。我们还将研究这两个环氧化步骤中涉及的氨基酸残基是否存在差异。今年，我们的目标是建立一个体外活性评价体系。我们研究了大肠杆菌和甲醇同化酵母中人工基因的表达系统，该系统针对大肠杆菌和酵母的密码子使用进行了优化。由于使用大肠杆菌表达系统无法确认蛋白质表达，因此我们将改用酵母表达系统。另外，通过使用计算化学软件MOE(Molsis)对AstE进行立体预测来估计对活性重要的氨基酸残基，并评估基于该结果创建的点突变酶的活性。我们对AstE、辅酶FAD和假定的中间体进行了对接模拟，选择了FMO环氧化部分与辅酶之间距离较近的模型，并研究了距离较近的酶（活性中心）的氨基酸残基。到基材。结果，鉴定了多个候选氨基酸残基。由于 AstE 预计会氧化两个不同的生物合成步骤，因此我们分析了每个假定的中间体。