松果体の光受容に関する神経行動学的研究

松果体感光的神经行为研究

• 批准号: 22K06321
• 负责人: 和田 清二
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Osaka Metropolitan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06321/
• 关键词: オプシン; 松果体; ゼブラフィッシュ

松果体に主要に存在する6種類のオプシンの内、3種類については、当該遺伝子のみをノックアウトした（シングルKO）ゼブラフィッシュ系統で、松果体の神経細胞で生じる光応答に野生型と異なるパターンが観察されており、3種の変異体の表現型は特定済みである。残りの3種類の内、2種類(LWS-opsin1/2)はノックアウト系統(i)が作製が滞っており、1種については変異体を作製したものの、野生型との顕著な差は観察されていない。そこで、2022年度は松果体オプシンノックアウト系統(i)を作製した。具体的にはCRISPR/Cas9によるゲノム編集により欠損させた個体を作製した。LWS-opsin1および2遺伝子は同一染色体上に存在する遺伝子重複により生じたもので、二つの塩基配列は酷似しているため、LWS-opsin1および2に対して同一の配列でgRNAを作製し、Cas9 mRNAとともにマイクロインジェクションすることでに2遺伝子を同時破壊した。一方で、酷似した塩基配列に伴い、PCRによる遺伝子型判定(genotyping)が通常のプロトコルでは困難であったため、複数のプライマーを用いるPCRによるgenotypingを最適化し、現在運用しており、新規に1系統（LWS-opsin1/2 KO系統）を得た。また予備的に、カルシウムイメージングにより、光応答に異常が生じることを確認した。さらに、既存の松果体オプシンKO個体との交配を繰り返し、6つの松果体オプシンが欠損した、松果体の光感受性が顕著に低下した系統（6-null 系統）を作製した。また、今後、上記のシングルKOによって表現型が得られていないものについて検討するために、当該遺伝子のみがKOされていない系統（部分変異体）を得ることが期待できる集団を飼育中である。

对于主要存在于松果体中的六种视蛋白中的三种，仅敲除相关基因（单一KO）的斑马鱼品系在松果体神经元中发生的光反应方面与野生型不同。已经观察到，并且已经鉴定了三个突变体的表型。其余三种类型中，两种类型（LWS-opsin1/2）的敲除系（i）的创建已被推迟，尽管为一种类型创建了突变体，但尚未观察到与野生型的显着差异。 。因此，我们在 2022 年创建了松果体视蛋白敲除系 (i)。具体来说，我们使用 CRISPR/Cas9 通过基因组编辑创建了具有缺失的个体。 LWS-opsin1和2基因是在同一条染色体上通过基因复制产生的，两个碱基序列非常相似，因此，用LWS-opsin1和2的相同序列创建了gRNA，而Cas9则同时破坏了这两个基因。通过显微注射 mRNA。另一方面，由于核苷酸序列非常相似，使用常规方案很难通过PCR进行基因分型，因此我们使用多个引物优化了PCR基因分型，并且目前正在操作它（LWS-opsin1/2 KO系）。我们还利用钙成像初步确认了光响应发生异常。此外，我们与现有的松果体视蛋白KO个体重复杂交，创建了一个缺乏六个松果体视蛋白并显着降低松果体光敏性的品系（6无效品系）。此外，为了调查上述单一KO未获得表型的情况，我们目前正在培育一个群体，在该群体中，我们有望获得仅相关基因未被获得的菌株（部分突变体）。 KO了。

项目成果

ゼブラフィッシュを用いた松果体光情報が伝達される脳領域の解析

使用斑马鱼分析松果体传输光学信息的大脑区域

• 发表时间: 2022
• 作者: 和田清二; 小柳 光正; 寺北 明久.
• 通讯作者: 寺北 明久.

ゼブラフィッシュを用いた果体オプシンの関わる光依存的行動の解析

使用斑马鱼分析与视蛋白相关的光依赖性行为

• 发表时间: 2022
• 作者: 和田清二; 小柳 光正; 寺北 明久.
• 通讯作者: 寺北 明久.

High-performance optical control of GPCR signaling by bistable animal opsins MosOpn3 and LamPP in a molecular property?dependent manner

双稳态动物视蛋白 MosOpn3 和 LamPP 以分子特性依赖性方式对 GPCR 信号进行高性能光学控制

• DOI: 10.1073/pnas.2204341119
• 发表时间: 2022
• 作者: Koyanagi Mitsumasa;Shen Baoguo;Nagata Takashi;Sun Lanfang;Wada Seiji;Kamimura Satomi;Kage;Terakita Akihisa
• 通讯作者: Terakita Akihisa

松果体オプシン欠損個体を用いたゼブラフィッシュの光依存的行動の解析

使用松果体视蛋白缺陷个体分析斑马鱼的光依赖性行为

• 发表时间: 2022
• 作者: 和田清二; 小柳 光正; 寺北 明久.
• 通讯作者: 寺北 明久.

Analyses of light-dependent behavior involving pineal photoreceptions using zebrafish larvae.

使用斑马鱼幼虫分析涉及松果体感光的光依赖性行为。

• 发表时间: 2022
• 作者: Seiji Wada; Mitsumasa Koyanagi; Akihisa Terakita.
• 通讯作者: Akihisa Terakita.