相同的組換えでの相同並行三重鎖DNAの働き

同源平行三链DNA在同源重组中的功能

基本信息

批准号：
22K06335
负责人：
柴田武彦
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

相同的組換えがDNA二本鎖切断を正確に修復してゲノムを維持する。相同的組換えの要は、切断端からできる単鎖(ss)DNA域が二重鎖(ds)DNAの中から互いに相同な配列を見つけハイブリッドds (Hyb-ds) を作る反応である。この反応の仕組みは未だに定説がない。単分子クライオ電子顕微鏡解析が示唆する、ある酵素がdsDNAの塩基対を開き、できたss域で相手のssDNAとアニールしてHyb-dsを作る「二重鎖開裂が先」モデルと、従来の生化学研究が支持する、ds構造が開く前にssDNAとの相同配列が見つけ出される「二重鎖開裂が後」モデルとがある。本研究の目的は、「二重鎖開裂が後」モデルにだけ想定される「相同並行三重鎖」の存在を示すことで、このモデルの確証を得る。ウイルスとミトコンドリア以外では、生物種に関わらず、ゲノムDNAの相同DNA組換えでは、RecAまたはそのorthologue (別種生物間で、共通の祖先を持ち同じ機能を担う遺伝子、それがコードする蛋白質）であるRAD51、DMC1がHyb-ds形成を行う。その原型であるRecA (蛋白質) は試験管内で高いHyb-ds形成活性を示すので本研究に最適であるが、形成したHyb-dsをＤループにして加工する機能を併せ持つ。そのため、Hyb-dsができた当初、相同並行三重鎖なのかＤループなのか未だに議論が決着しない。Ｄループ安定化と加工の要はRecAやRAD51, DMC1が単鎖DNAと形成するラセン繊維状構造の内側でＤループに接するL2ループ部位にあることが立体分子構造解析の結果から示唆されている。令和４年度は、L2ループの変異蛋白質の大量精製のシステムを確立し、必要な量の野生型RecAとL2ループ変異蛋白質を調製し、変異RecA (蛋白質) の生化学的な性状を明らかにするため、野生型RecAとの比較解析に着手した。

同源重组通过精确修复 DNA 双链断裂来维持基因组。同源重组的关键是从切割末端产生的单链 (ss) DNA 区域在双链 (ds) DNA 中找到相互同源的序列，从而产生杂合 ds (Hyb-ds) 的反应。该反应的机理尚未明确。单分子冷冻电子显微镜分析表明，某种酶打开 dsDNA 中的碱基对，并与所创建的 ss 区域中的伙伴 ssDNA 退火，形成 Hyb-ds，这是“双链优先”模型，而传统的生物化学研究支持“双链切割后”模型，其中在双链结构打开之前发现了单链DNA的同源序列。本研究的目的是通过证明“同源平行三链体”的存在来证实该模型，“同源平行三链体”仅在“切割后双链切割”模型中假设。在病毒和线粒体以外的情况下，无论生物物种如何，在基因组DNA的同源DNA重组中，RecA或其直系同源物（具有共同祖先并在不同物种之间发挥相同功能的基因及其编码的蛋白质）是使用 RAD51 和 DMC1 进行 Hyb-ds 形成。其原型 RecA（蛋白质）非常适合本研究，因为它在体外表现出高 Hyb-ds 形成活性，而且还具有将形成的 Hyb-ds 加工成 D 环的能力。因此，当 Hyb-ds 首次创建时，关于它是同源并行三链还是 D 环的争论仍然没有解决。三维分子结构分析结果表明，D-loop稳定和加工的关键点是RecA、RAD51和DMC1与单链DNA形成的螺旋纤维结构内与D-loop接触的L2环位点. 2020财年，我们建立了L2环突变蛋白的大规模纯化系统，制备了所需量的野生型RecA和L2环突变蛋白，并阐明了突变RecA（蛋白）的生化特性，因此我们开始与L2环突变蛋白进行比较分析。野生型RecA。