酸素発生型光合成を制御する新規プロトン膜透過機構の解明

阐明控制放氧光合作用的新型质子膜渗透机制

基本信息

批准号：
22K06276
负责人：
増田真二
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では、これまで筆者らが同定した、葉緑体包膜に局在しプロトンの膜透過を光依存的に行うDLDG1とYcf10、さらに葉緑体の包膜とチラコイド膜の両方に局在するFLAP1の遺伝学的・生化学的解析を進めることで、これら新規の因子に依存した新たなプロトン膜移動の存在とその機能を明らかにすることを目指す。今年度の成果を以下にまとめる。１）FLAP1の相互作用因子の同定：これまでに、プロテインA（ProA）を融合したFLAP1を発現するシロイヌナズナ株の作出に成功している。R4年度は、このラインからIgGカラムを用いて、可溶化したチラコイド膜からProA-FLAP1の精製を行い、これに結合しているタンパク質の同定を行うことを目指した。その結果、ジギトニンにより可溶化したチラコイド膜画分よりProA-FLAP1を精製する系の構築に成功した。２）dldg1変異体のサプレッサー変異体の単離：dldg1変異体は連続光で育てると若い葉がペールグリーンになる表現型を示す。これまでに、EMS処理を施したdldg1変異体からペールグリーンの表現型が回復したサプレッサー（抑圧）変異体の作出を進め、複数の抑圧変異体の単離に成功している。R4年度は、いくつかの抑圧変異体の原因遺伝子の同定を行った。具体的には、各抑圧変異体の変異箇所をゲノムリシーケンシングのデータをもとに絞り込んだ。３）シアノバクテリアの解析：DLDG1, Ycf10, FLAP1はシアノバクテリアを含む酸素発生型光合成生物に特異的に保存されている。単細胞生物のシアノバクテリアを用いてこれらのオーソログを解析することで、これら因子のより詳細な生理機能の解明に迫れると考えられる。そこで、シアノバクテリアの各変異体にpH指示タンパク質Luphinを発現させ、光照射に伴う細胞質のpH変化をリアルタイムでモニターできる系の構築に成功した。

在本研究中，我们将重点关注 DLDG1 和 Ycf10，它们位于叶绿体包膜中，并以光依赖性方式进行质子膜渗透，作者之前已经鉴定过它们，并且它们位于叶绿体包膜和类囊体膜中通过对 FLAP1 进行遗传和生化分析，我们的目的是阐明依赖于这些新因素的新质子膜运输的存在和功能。今年的结果总结如下。 1）FLAP1相互作用因子的鉴定：迄今为止，我们已经成功创建了表达与蛋白A（ProA）融合的FLAP1的拟南芥菌株。在 R4 年，我们的目标是使用该系列的 IgG 柱从溶解的类囊体膜中纯化 ProA-FLAP1，并鉴定与其结合的蛋白质。结果，我们成功构建了从洋地黄皂苷溶解的类囊体膜组分中纯化 ProA-FLAP1 的系统。 2）dldg1突变体抑制突变体的分离：当在连续光照下生长时，dldg1突变体在幼叶中表现出淡绿色表型。迄今为止，我们已经创建了抑制突变体，可以从 EMS 处理的 dldg1 突变体中恢复淡绿色表型，并成功分离出多个抑制突变体。在R4年，我们鉴定了几个受抑制突变体的致病基因。具体来说，我们根据基因组重测序数据缩小了每个抑制突变体中的突变位点。 3）蓝藻的分析：DLDG1、Ycf10和FLAP1在包括蓝藻在内的产氧光合生物中特异保守。通过使用单细胞生物蓝细菌分析这些直向同源物，我们将能够阐明这些因子的更详细的生理功能。因此，他们在各种蓝藻突变体中表达了pH指示蛋白Luphin，并成功构建了一个可以实时监测光照射导致的细胞质pH变化的系统。