基底膜タンパク質の局在決定機構と物理構造の必要性の解析

基底膜蛋白物理结构定位机制及必要性分析

• 批准号: 22K06209
• 负责人: 伊原 伸治
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Prefectural University of Hiroshima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06209/
• 关键词: 基底膜; 線虫; IV型コラーゲン; 細胞外マトリックス

本研究では、基底膜タンパク質の局在決定機構を明らかにするために、ゲノム編集技術を用いて、これまでに見出した局在異常を示すP1591S変異をもつIV型コラーゲンとin-frameでG2ドメインを欠損したナイドジェン（変異型ナイドジェン）の可視化を試みた。また、ナイドジェンの偏在化した局在がナイドジェンの発現量に依存するかを明らかにするために、体全体の体壁筋細胞で強い発現誘導するmyo-3プロモーター（L3幼虫期でも発現誘導は維持される）でナイドジェンの異所的な発現誘導を行い、L3幼虫期のナイドジェンの咽頭基底膜の局在変動の観察を行った。変異型IV型コラーゲンの可視化を行うために、生殖細胞でCas9が高発現する線虫を用いて内在性のIV型コラーゲンの可視化を試みたが、これまでに変異型IV型コラーゲンの可視化には成功していない。一方、変異型ナイドジェンは可視化に成功しており、G2ドメインが欠損した変異型ナイドジェンは腸管基底膜に殆ど局在しないことが明らかになった。さらにmyo-3プロモーターでナイドジェンを異所的に発現させると、L3幼虫期のナイドジェンの咽頭基底膜の局在変動が観察されなかった。またG2ドメインが欠損したナイドジェンの変異体では、IV型コラーゲン、ラミニン、へミセンチンの局在異常は観察されなかった。以上の結果より、ナイドジェンのG2ドメインが腸管基底膜に存在するために必要なこと、咽頭基底膜の局在変動は発現量に依存していること、ナイドジェンのG2ドメインの欠損は他の基底膜の局在決定に関与しないことが明らかになった。さらに基底膜の物理構造を変化させるためにハブ粗毒を用い基底膜の分解を試みた。現在、ハブ粗毒がどの基底膜を優先的に分解するのか、解析中である。

在本研究中，为了阐明基底膜蛋白的定位机制，我们利用基因组编辑技术构建了具有P1591S突变的IV型胶原框内的G2结构域，该突变表现出我们之前发现的定位异常。想象 Nidogen 缺乏（突变体 Nidogen）。此外，为了阐明 nidogen 的普遍定位是否依赖于 nidogen 的表达水平，我们研究了 myo-3 启动子，它强烈诱导全身体壁肌肉细胞的表达（即使在 L3 幼虫中也能诱导表达）我们在 L3 幼虫阶段诱导巢蛋白的异位表达，并观察巢蛋白在咽基底膜中定位的变化。为了可视化突变 IV 型胶原蛋白，我们尝试使用生殖细胞中高度表达 Cas9 的线虫来可视化内源 IV 型胶原蛋白，但没有成功。另一方面，突变型巢蛋白被成功地可视化，并且表明缺乏G2结构域的突变型巢蛋白几乎不定位于肠基底膜中。此外，当使用 myo-3 启动子异位表达 nidogen 时，在 L3 幼虫阶段，在咽基底膜中没有观察到 nidogen 的定位。此外，在缺乏 G2 结构域的 Nidogen 突变体中没有观察到 IV 型胶原、层粘连蛋白或半中心蛋白的异常定位。上述结果表明，Nidogen的G2结构域对于其在肠基底膜中的存在是必需的，咽基底膜中的定位变化取决于表达水平，并且Nidogen的G2结构域的缺失是由于其存在而引起的。研究表明该蛋白不参与定位测定。此外，为了改变基底膜的物理结构，我们尝试使用粗哈布毒素降解基底膜。我们目前正在分析哈布毒素优先降解哪些基底膜。