3分子同時計測による、神経細胞内ATP産生のMg2+による制御メカニズムの解明

通过同时测量三个分子阐明 Mg2+ 神经元内 ATP 产生的控制机制

• 批准号: 22K06165
• 负责人: 新藤 豊
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06165/
• 关键词: 蛍光イメージング; 遺伝子コード型センサー; ピルビン酸; ATP; グルタミン酸; エネルギー代謝; 神経細胞; 同時計測; マグネシウム

本研究の目的は「ATP産生にかかわる分子2種類およびMg2+の3分子同時計測系を構築し、神経細胞内Mg2+濃度変動がATP産生に与える影響を相関解析から推定し、その因果関係を確かめること」である。初年度は、A, 既存のCFP-YFPペアのFRET型センサーの蛍光タンパク質を入れ替え橙色-赤色のFRET型センサーの開発を進めた。また、B, 分散培養したラット海馬神経を、脳内で主要な興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸で刺激した際の細胞内Ca2+, Mg2+濃度変化を測定し、刺激グルタミン酸濃度や神経細胞の成熟とそれらのイオンの濃度変化の関係性について調べた。A：既存の乳酸センサー、ピルビン酸センサーを基に、蛍光タンパク質を入れ替えたものを複数種類作製し、HeLa細胞に発現させて性能を確認した。乳酸センサーは乳酸濃度変化によりFRET比を大きく変化させるものがなかったが、ピルビン酸センサーでは1つの候補で細胞内のピルビン酸濃度変化に応じたFRET比の変化が確認された。これを橙色-赤色ピルビン酸センサーのプロトタイプとし、今後の性能評価へと進める予定である。また、本研究開始以前から開発していた橙色-赤色ペアのFRET型ATPセンサーについても、性能評価実験および、論文発表の準備を進めた。B：培養期間の異なる神経細胞を、それぞれ1, 10, 100, 500マイクロMのグルタミン酸で刺激した際の応答を観察した。2週間程度培養し、ある程度成熟した神経細胞では1マイクロMのグルタミン酸であってもMg2+濃度上昇を引き起こすこと、10マイクロM以上では神経細胞死に関連するMg2+濃度減少が起こってしまうことを発見した。これらの結果から、培養1週間程度の未成熟な神経では10～100マイクロM程度、成熟した神経では1～10マイクロM程度のグルタミン酸が刺激に適切であることが分かった。

本研究的目的是构建一个同时测量参与 ATP 产生的两类分子和 Mg2+ 的三种分子的系统，通过相关分析估计神经元内 Mg2+ 浓度波动对 ATP 产生的影响，并确认因果关系。” 。第一年，A.我们替换了现有CFP-YFP对FRET传感器中的荧光蛋白，开发了橙红色FRET传感器。此外，B. 当用谷氨酸（大脑中主要的兴奋性神经递质）刺激分散培养的大鼠海马神经元时，我们测量了细胞内 Ca2+ 和 Mg2+ 浓度的变化，并研究了刺激的谷氨酸浓度和神经元成熟的影响。这些离子浓度变化之间的关系。答：我们基于现有的具有不同荧光蛋白的乳酸和丙酮酸传感器创建了多种类型的传感器，并通过在 HeLa 细胞中表达它们来证实它们的性能。由于乳酸浓度的变化，没有一种乳酸传感器显着改变 FRET 比率，但证实一种候选丙酮酸传感器的 FRET 比率随细胞内丙酮酸浓度的变化而变化。我们计划使用它作为橙红色丙酮酸传感器的原型，并继续进行未来的性能评估。我们还对在本研究开始之前开发的橙红对FRET型ATP传感器进行了性能评估实验和论文发表准备。 B：用1、10、100和500μM谷氨酸刺激培养不同时期的神经元时观察到反应。培养约两周后，他们发现即使是1μM的谷氨酸也会导致成熟到一定程度的神经元中Mg2+浓度增加，而10μM或更多的谷氨酸会导致Mg2+浓度下降，即与神经元细胞死亡有关。由这些结果可知，对于培养1周左右的未成熟神经的刺激，大约10～100μM的谷氨酸是适当的，对于成熟神经的刺激，大约1～10μM的谷氨酸是适当的。

项目成果

The roles of intracellular magnesium ion revealed by fluorescence imaging

荧光成像揭示细胞内镁离子的作用

• 发表时间: 2022
• 作者: 新藤 豊