脱リン酸化を介した神経細胞カルシウムシグナル全貌解明のための基盤研究

通过去磷酸化阐明神经元钙信号完整情况的基础研究

• 批准号: 22K06139
• 负责人: 千村 崇彦
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06139/
• 关键词: シグナル伝達; 神経可塑性; カルシウム

「カルシウムイオンがどのように神経可塑性を制御するのか?」この根源的な問いに答えるため、神経細胞に発現する蛋白質に着目し、その分子的特性を調節するリン酸化状態、特にカルシウム依存的に起こる脱リン酸化反応の制御機構を解明する。新規に発見した神経細胞における脱リン酸化反応と、それをin vitroで再現する独自に構築したin vitro脱リン酸化反応系を用い、以下の２点を主たる研究の柱として解析を進めている。(1)神経細胞に発現している機能未知分子として我々が独自に単離した新規蛋白質UF1が前述の脱リン酸化制御に果たす役割を明らかにすること、(2)当該脱リン酸化反応の標的となる新規な基質蛋白質を、質量分析などのプロテオミクス解析を用いて網羅的に探索し、脱リン酸化反応の全体像を明らかにすること。2022年度の進捗状況は以下の通りである。(1)UF1の生化学的特性の解析を行うため、大腸菌リコンビナント蛋白質精製条件の確立、及び生化学的アッセイ法の確立を重点的に進めた。リコンビナントUF1をGST融合蛋白質として精製条件を確立した。また、溶出に用いた還元型グルタチオン、及びGST蛋白質それ自体は脱リン酸化反応に影響を与えないことを確認し、GST融合蛋白質存在下でのin vitro脱リン酸反応の条件を確立した。当該条件においてGST-UF1の脱リン酸化反応に対する影響を計測したところ、UF1には脱リン酸化抑制活性があることが判明した。この発見は、神経細胞におけるシグナル伝達系の理解において極めて重要な知見である。(2)脱リン酸化反応の標的となる新規蛋白質の網羅的解析を進めるため、質量分析に供するサンプルの調製方法、蛋白質量の検討を進めた。マウス脳抽出液を用いる方法と、神経細胞の初代培養細胞の抽出液を用いる方法を比較し、前者の方が質的に優れた方法であることを確認した。

“钙离子如何控制神经可塑性？”为了回答这个基本问题，我们重点研究了神经细胞中表达的蛋白质，并研究了调节其分子特性的磷酸化状态，特别是以钙依赖性方式阐明了去磷酸化反应的控制机制。发生这种情况。利用新发现的神经细胞去磷酸化反应和独特构建的可在体外重现该反应的体外去磷酸化反应系统，我们正在对以下两个主要研究支柱进行分析。 (1)阐明我们独立分离的新蛋白UF1在控制上述去磷酸化中的作用，该蛋白是我们独立分离的在神经细胞中表达的功能未知的分子，以及(2)阐明我们的去磷酸化反应的目标。目的是利用质谱等蛋白质组分析全面寻找可导致去磷酸化的新型底物蛋白，并阐明去磷酸化反应的整体情况。 2022财年的进展情况如下。 (1)为了分析UF1的生化特性，我们重点建立了大肠杆菌重组蛋白的纯化条件和生化检测方法。建立了重组 UF1 作为 GST 融合蛋白的纯化条件。此外，我们确认了用于洗脱的还原型谷胱甘肽和GST蛋白本身不会影响去磷酸化反应，并建立了在GST融合蛋白存在下进行体外去磷酸化反应的条件。当在这些条件下测量GST-UF1对去磷酸化反应的影响时，发现UF1具有去磷酸化抑制活性。这一发现对于理解神经细胞中的信号转导系统极其重要。 (2)为了全面分析去磷酸化反应靶标的新蛋白，我们对质谱样品的制备方法和蛋白含量进行了研究。他们比较了使用小鼠脑提取物的方法和使用原代培养神经细胞提取物的方法，并证实前一种方法在质量上更优越。